1、 ICS 65.020.01 CCS B 16 35 福建省地方标准 DB35/T 1943 2020 百香果（西番莲）病毒检测技术规程 Technical rules for virus detection of passiflora edulia 2020 - 12 - 30 发布 2021 - 03 - 30 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 1943 2020 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由福建省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：福建省种植业技术推广总站、福建省农业科学院果树研
2、究所。 本文件主要起草人：李韬、谢丽雪、施清、杨建榕、张立杰、张小艳、郑姗、谢钟琛、林诚智。 DB35/T 1943 2020 1 百香果（西番莲）病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了百香果主要病毒的检测对象、仪器设备、用具及试剂、抽样、检测、结果判定、结果 记录、样品保存和归档。 本文件适用于百香果上主要病毒（东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、黄瓜花叶病毒）的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6
3、682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 检测对象 选择西番莲生产上分布范围广、 危害严重的东亚西番莲病毒 （ East Asian passiflora virus， EAPV） 、 夜来香花叶病毒（ Telosma mosaic virus，TeMV）、黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus，CMV）为 检测对象，各病毒的信息参见附录A。 5 仪器设备、用具及试剂 5.1 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平（1/100 0 g）、
4、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20 低温冰箱和-80 超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉 、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压 灭菌锅、酶标仪等。 5.2 用具 各种量程的可调移液器（100 0 L、200 L、100 L、20 L、10 L、2 L）、PCR反应管、 无RNase的PCR离心管（1.5 mL）、研钵、酶联板等。 5.3 试剂 DB35/T 1943 2020 2 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。DAS-ELISA试剂按照 附录B要求，RT-PCR试剂按照附录C要求。 6 抽样 有病毒危害症状的植物材料（叶、果实）单独抽样；无
5、危害症状的植物材料（叶、果实）抽样方法 按照SN/T 2122和SN/T 2964中规定执行。 7 检测 7.1 DAS-ELISA DAS-ELISA具体方法按照附录B检测。 7.2 RT-PCR RT-PCR具体方法按照附录C检测。 8 结果判定 8.1 东亚西番莲病毒 若样品经DAS-ELISA、 RT-PCR检测结果均为阳性， 则判定为检出EAPV； 若样品经RT-PCR检测为阳性， 且序列测定结果为该病毒核苷酸序列，则判定为检出EAPV；反之，则判定为未检出EAPV。 8.2 夜来香花叶病毒 若样品经DAS-ELISA、 RT-PCR检测结果均为阳性， 则判定为检出TeMV； 若样品
6、经RT-PCR检测为阳性， 且序列测定结果为该病毒核苷酸序列，则判定为检出TeMV；反之，则判定为未检出TeMV。 8.3 黄瓜花叶病毒 若样品经DAS-ELISA、RT-PCR 检测结果均为阳性，则判定为检出CMV；若样品经RT-PCR检测为阳性， 且序列测定结果为该病毒核苷酸序列，则判定为检出CMV；反之，则判定为未检出CMV。 9 结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA 检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片。 10 样品保存和归档 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20 -80 冰箱中，并作好登记和标
7、记工作，以备 复核用。 DB35/T 1943 2020 3 A A 附录A （资料性） 东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、黄瓜花叶病毒的背景资料 A.1 分类地位 A.1.1 东亚西番莲病毒 学名： East Asian passiflora virus，缩写：EAPV。 分类地位：马铃薯Y病毒科（ Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（ Potyvirus）成员。 A.1.2 夜来香花叶病毒 学名： Telosma mosaic virus，缩写：TeMV。 分类地位：马铃薯Y病毒科（ Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（ Potyvirus）成员。 A.1.3 黄瓜花叶病毒 学名
8、： Cucumber mosaic virus，缩写：CMV。 分类地位：雀麦花叶病毒科（ Bromoviridae）、黄瓜花叶病毒属（ Cucumovirus）成员。 A.2 分布地区 EAPV：主要分布于日本、韩国以及我国台湾地区；TeMV：主要分布于越南、泰国、印度尼西亚、中 国；CMV：国内外西番莲种植地区均有分布。 A.3 危害症状 EAPV：主要引起西番莲叶片花叶、果实畸形和 木质化，见图A.1；TeMV：主要引起叶片花叶，见图 A.2；CMV：叶片出现亮黄色的斑点，见图A.3。 图A.1 EAPV 侵染引起的症状 DB35/T 1943 2020 4 图A.2 TeMV 侵染引起
9、的症状 图A.3 CMV 侵染引起的症状 A.4 传播途径 EAPV: 蚜虫、机械摩擦传播；TeMV：机械摩擦传播；CMV：蚜虫、机械摩擦传播。 A.5 粒体形态 EAPV：线状粒体，长约800 nm；TeMV：线状粒体，长约750 nm；CMV：球状粒体，直径 28 nm 30 nm。 DB35/T 1943 2020 5 B B 附录B （规范性） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） B.1 试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的病毒（EAPV、TeMV、CMV）抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠（NPP）。 B.1.
10、4 1PBST缓冲液（pH 7.4） 氯化钠（NaCl） 8.0 g 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2HPO4） 1.15 g 氯化钾（KCl） 0.2 g 吐温-20（Tween-20） 0.5 mL 溶于900 mL灭菌ddH 2O中，并定容至1 000 mL，4 储存。 B.1.5 样品抽提缓冲液（pH 7.4） 亚硫酸钠（Na 2SO3） 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP, MW24 000-4 0 000） 20.0 g 溶于900 mL的1PBST中，并用1 PBST定容至1 000 mL，4 储存。 B.1.6 包被缓冲液（pH 9.6） 碳酸钠
11、（Na 2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO 3） 2.93 g 溶于900 mL灭菌ddH 2O中，并定容至1 000 mL，4 储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液（pH 7.4） 牛血清白蛋白（BSA） 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP, MW24 000-4 0 000） 20.0 g 溶于900 mL 1PBST中，并用1P BST定容至1 000 mL，4 储存。 B.1.8 底物缓冲液(pH 9.8) 二乙醇胺 97 mL 氯化镁（MgCl 2） 0.1 g 溶于800 mL灭菌ddH 2O中，用浓盐酸（HCl）调pH至9.8，定容 至1 000 mL，4 储存。
12、 B.2 程序 DB35/T 1943 2020 6 B.2.1 样品制备 B.2.1.1 待测样品 称取0.5 g1.0 g样品组织，待测样品按1:10（重量:体积，W/V）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成 浆，800 0 g离心10 min，上清即为制备好的检测样品。 B.2.1.2 阳性对照样品 携带相关病毒的样品组织抽提液。 B.2.1.3 阴性对照样品 健康的西番莲叶片组织抽提液。 B.2.1.4 空白对照 用抽提缓冲液作空白对照。 B.2.2 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100 L/孔，加盖，37 孵育2 h或4 冰 箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔
13、200 L的量用PBST洗涤46次，每次1 min。 B.2.3 加样 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，2个重复，100 L/孔，加盖，37 孵 育2 h或4 冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200 L的量用PBST洗涤46次，每次1 min。 B.2.4 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度， 并加入到酶联板中， 100 L/孔， 加盖， 37 孵育2 h，倒去酶联板孔中溶液，PBST洗涤46次，每次1 min。 B.2.5 加底物 将底物 NPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1 mg/mL（现配现用），按100 L/孔，加入到酶联板 中，
14、室温避光孵育30 min。 B.2.6 读数 酶标仪在405 nm处读OD值。 B.3 结果判断 在满足阴性对照的OD405 nm值510、重 复性基本一致的质量要求下： a) 样品 OD405 nm 值/阴性对照 OD405 nm 值2，判为阳性； b) 样品 OD405 nm 值/阴性对照 OD405 nm 值2，判为阴性； c) 样品 OD405 nm 值/阴性对照 OD405 nm 值在阈值 2 附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用 其他方法加以验证。 DB35/T 1943 2020 7 C C 附录C （规范性） 普通 RT-PCR 检测方法 C.1 试剂 C.1.1 Trizo
15、L裂解液 C.1.2 5TBE缓冲液 Tris碱 54.0 g 硼酸（H 3BO3） 27.5 g 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20mL 补充蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至0.5TBE。 C.1.3 6加样缓冲液 0.25%溴酚蓝 40%（W/V）蔗糖水溶液。 C.1.4 氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇。 C.1.5 RT缓冲液。 C.1.6 dNTPs：10 mmol/L。 C.1.7 M-MLVRT：200 U/L。 C.1.8 RNasin：40 U/L。 C.1.9 Taq PCR mix。 C.1.10 引物序列 根据已报道的东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、黄瓜
16、花叶病毒基因组序列设计用于特异性扩增的 引物（表C.1）。 表C.1 PCR 扩增引物 病毒名称 引物名称 引物序列（5-3） 目的片段（bp） 东亚西番莲病毒 正向引物 EAPV-F CTTGCATGTCCTAGACCTCG 955 反向引物 EAPV-R AACTGTGGTCGGTTTACCCAA 夜来香花叶病毒 正向引物 TeMV-F TCAAGTAAGGTGGATGATGTT 816 反向引物 TeMV-R CTGCACAGAGCCAACCCCAA 黄瓜花叶病毒 正向引物 CMV-F ATGGACAAATCTGAATCAACC 657 反向引物 CMV-R TCAGACTGGGAGCA
17、CTCCA C.2 RT-PCR 检测 DB35/T 1943 2020 8 C.2.1 总RNA提取 样品提取液的制备同B.2.1。取样品提取液200 L放入1.5 mL离心管中，再加入1 mL TrizoL试剂， 剧烈震荡摇匀3 min；4 ，12 000 g离心1 0 min，取上清；加入氯仿300 L，剧烈震荡15 s，室温静 置5 min， 4 ， 12 000 g离心15 min， 取上层水相； 加入等体积的异丙醇， 颠倒混匀后室温下静置15 min， 4 ，12 000 g离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀2次，7 500 g离心3 min，弃上清 ；
18、RNA沉淀干燥后，用20 L40 L经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的ddH2O溶解，-80 保存备用。 C.2.2 cDNA合成 在PCR管中加入3 L总RNA，1 L反向引物（10 mol/L），DEPC处理过的ddH2O 7 L，70 水 浴10 min，迅速冰浴5 min，再加入下列试剂：5RT 缓冲液5 L、dNTPs（10 mmol/L）2 L、M-MLVRT （200 U/L）1 L、RNasin（40 U/L） 1 L。42 水浴60 min，70 水浴10 min，自然 冷却至 室温，-20 保存备用。 C.2.3 PCR扩增 PCR反应体系见表C.2，每个反应设置2 个重复
19、。检测时以含有病毒目标片 段的质粒或含病毒材料作 为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。 EAPV的PCR反应条件：94 预变性5 min, 然后94 变性 30 s、48 退火45 s、 72 延伸1 min， 35个循环，最后一个循环结束后72 继续延伸10 min。 TeMV的PCR反应条件：94 预变性5 min, 然后94 变性30 s、55 退火1 min、72 延伸1 min， 35个循环，最后一个循环结束后72 继续延伸10 min。 CMV的PCR反应条件：94 预变性5 min, 然后94 变性 30 s、55 退火45 s、72 延
20、伸1 min， 35个循环，最后一个循环结束后72 继续延伸10 min。 表C.2 PCR 扩增反应体系 名称 加样量/ L cDNA 2.0 正向引物 (10 mol/L) 1.0 反向引物 (10 mol/L) 1.0 2 Taq PCR mix 12.5 ddH2O 8.5 总体积 25.0 C.2.4 琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳。电泳结束后，在溴化乙锭（EB，浓度为0.5 g/mL） 溶液染色10 min，再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍照并做记录。 C.2.5 结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测 样品出现与阳性对照一致的扩增条带（EAPV、TeMV、 CMV分别为955 bp、816 bp、657 bp），则判定为阳性。 如果阳性对照、 阴性对照和空白对照正常， 待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带 （EAPV、 TeMV、 CMV分别为955 bp、816 bp、657 bp），则判定为阴性。 DB35/T 1943 2020 9 C.2.6 序列测定 PCR产物采用直接测序或克隆测序，测序获得的核苷酸序列与已知的病毒序列进行比对。序列比对 采用国际基因数据库GenBank中的BLAST程序。
