1、ICS 65.020.30 B 51 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 4131 2020 刺参细菌性腐皮综合征调查技术规范 The specification for the survey technology of the bacterial skin ulcer syndrome of Apostichopus japonicus 2020 - 09 - 25 发布 2020 - 10 - 25 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 41312020 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标
2、准由山东省农业标准化技术委员会渔业标准化分技术委员会 (TC 17/SC03)归口。 本标准起草单位：山东省海洋生物研究院。 本标准主要起草人：樊英、许拉、王淑娴、李乐、王晓璐、于晓清、盖春蕾、刁菁、叶海斌、刘洪 军、李天保。 DB37/T 41312020 1 刺参细菌性腐皮综合征调查技术规范 1 范围 本标准规定了刺参 (Apostichopus japonicus)细菌性腐皮综合征 (bacterial skin ulcer syndrome) 调查的总体要求，以及最初调查、现场调查、追踪调查各阶段的内容与要求。 本标准适用于山东省刺参细菌性腐皮综合征的流行病学调查。 2 规范性引用文件
3、 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 11607 渔业水质 标准 GB 13078 饲料卫生标准 GB 17378.6 海洋监测规范 第 6部分：生物体分析 GB 17378.7 海洋监测规范 第 7部分：近海污染生态调查和生物 GB/T 32756 刺参 亲参和苗种 NY 5052 无公害食品 海水养殖用水水质 NY 5070 无公害食品 水产品中渔药残留限量 NY 5071 无公害食品 渔用药物使用准则 SC/T 2037 刺参配合饲料 DB37/T 442 无
4、公害食品 刺参养殖技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 刺参细菌性腐皮综合征 bacterial skin ulcer syndrome of Apostichopus japonicus 由细菌性病原引起的刺参身体收缩僵直、口部肿胀、摇头、排脏、表皮溃烂等一系列复杂表征。 注： 该病多发生在秋冬以及早春低温季节，感染率高，危害严重。 4 总体要求 4.1 调查流程 调查流程一般包括： a) 最初调查：由疾病发生地渔业技术服务机构进行的初步调查； b) 现场调查：在最初调查标记为疑似刺参细菌性腐皮综合征后，由上一级渔业技术服务机构进行 的全面调查，诊断疾病情况，提出监
5、测区域划定； DB37/T 41312020 2 c) 追踪调查：在现场调查判定为刺参细菌性腐皮综合 征后，由上一级渔业技术服务机构组织有关 专家进行的全面调查，评估疾病风险，提出监测要求及防控建议。 4.2 调查原则 应遵循以下原则开展调查： a) 科学性：以科学信息为基础； b) 全面性：以最初、现场、追踪调查为内容； c) 限制 性：以限制条件、不确定因素、成本和 效果的平衡为补充。 4.3 调查取证 4.3.1 应有生产档案以及相关照片、录音、录像等视听资料。 4.3.2 应有书面调查表。 4.3.3 应有调查询问记录、查阅资料记录。 4.4 调查报告 应有调查证据为支撑，对原始证明材
6、料做好标识和保存。 5 最初调查 5.1 调查人员接到报告后应立即到达疾病发生地对疾病进行核实。通过观察刺参身 体是否出现收缩僵 直、口部肿胀、摇头、排脏，以及表皮溃烂等征状。如出现上述征状，标记为疑似刺参细菌性腐皮综合 征。 5.2 标记为疑似刺参细菌性腐皮综合征后，调查人员应做好采样、送样和留样工作，填写最初调查表 (参 见附录 A)，同时报告上一级渔业技术服务机构。 6 现场调查 6.1 最初调查标记为疑似刺参细菌性腐皮综合征后，专业人员立即按照附录 B 的要求对细菌性病原进 行诊断。 6.2 诊断确定刺参细菌性腐皮综合征病原存在，遵循“早发现、早隔离、早治疗”原则，及时将疾病 严重个体
7、拣出后掩埋或无害化处理，无发病或发病轻的个体可用氨基糖苷类抗菌素或土霉 素等抗生素进 行药浴和口服。 6.3 专业调查人员应根据调查、诊断、治疗情况，提出处理措施和技术方案，协助疾病发生地做好后 续监测，填写现场调查表（参见附录 C）。 7 追踪调查 7.1 现场调查判定为刺参细菌性腐皮综合征后，上一级渔业技术服务机构应组织专家对疾病情况、可 能来源、感染范围、传播范围及相关的风险进行评估，追踪流出疾病发生地的水生动物及产品流向，做 好溯源调查，提出防控建议。 7.2 专业调查人员填写追踪调查表（参见附录 D）。 7.3 上一级渔业技术服务机构应组织有关专家确定可能受到威胁的区域，提出监测技术
8、方案。技术方 案应符合附录 E 的要求 。 DB37/T 41312020 3 8 调查报告 8.1 流行病学调查报告： a) 应包括任务来源、监测地点、监测方式和要求、监测时间和对象、监测过程、资料记录及分析、 监测结果及建议； b) 应涉及监测地点现场调查、追踪调查、溯源调查，以及可能发生的公共预警预报。 c) 附件应有佐证和结论。 8.2 流行病学调查报告参见附录 F。 DB37/T 41312020 4 A A 附 录 A （资料性附录） 最初调查表 最初调查表参见表 A.1。 表 A.1 最初调查表 调查来源 调查时间 调查人员 姓名 电话 单位 疾病发生地 情况 名称： 负责人姓名
9、： 联系方式： 地址： 周边环境： 养殖条件情况 水质条件： (温度、盐度、酸碱度、溶氧、氨氮、浮游动植物、微量元素、光照 ) 饲料条件： 设施条件： (育苗池、养殖池、饵料池、供水系统、供热系统、供电系统，包括进排 水管道、底栖环境、附着基等 ) 其他： 养殖对象状况 体表： 体色： 肉刺状态： 体壁： 嘴部： 腹部： 运动伸展状况： 疾病核实情况 刺参规格： 发病数量： 水温 ： pH： 溶解氧 ： 发病率 ： 死亡率 ： 典型 征 状： 急性发病死亡 体色正常 (棕色 /淡红色 /绿色 )或发白 体表溃烂 嘴部肿大或溃烂 运动异常 体表肉刺完整或异常 腹部平滑或异常 发病期天气 状况 天
10、气总体状况： 温度： 其他： 发病范围 单个养殖车间 /池塘 单个养殖场 附近养殖场 附近乡镇 跨县、区、市 其他 近三年疾病 发生情况 从轻到重记录： DB37/T 41312020 5 表 A.1 最初调查表 （续） 防控条件 防控措施： 防控手段： 处理措施 ： 检测实验室 无害化处理 兽医机构 其他 采样 、 留样情况 采样： 是 否 采样情况： 送检： 是 否 送检单位： 送检时间、批次： 留样情况： 留样时间及批次： 留样保存情况： 其他 病情核实结论 疑似刺参细菌性腐皮综合征： 是 否 其他： 记录人签字： 核实人签字： 单位盖章 年 月 日 DB37/T 41312020 6
11、B B 附 录 B （规范性附录） 刺参细菌性 腐皮综合征病原菌诊断 B.1 病原菌分离、纯化 取病灶组织剪碎、无菌研钵研磨，用无菌接种环挑取少许组织，在营养肉汤琼脂培养基上划线分离， 置 28 培养 1 d 2 d后挑取优势菌落，重复培养 3次以获得纯化菌株。记录纯化菌株的形状、大小、颜 色、光泽、隆起形状、粘稠度、透明度、边缘特征等。 B.2 病原菌鉴定 B.2.1 形态学检测 B.2.1.1 将纯培养细菌菌株经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，记录菌体形状、大小情况，有无鞭 毛及鞭毛位置和数量，是否产生芽孢及芽孢位置和形状等。参照伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌 系统鉴定手册，从菌落形态上分析
12、病原菌特 征。 B.2.1.2 挑取单菌落，用 2 %戊二醛电镜固定液固定数分钟，取一滴固定好的菌液置于铜网上，以 3 % 磷钨酸负染，晾干，在透射电镜下观察，分析记录病原菌特征。 B.2.2 生理生化检测 将纯培养细菌菌株接种于特定培养物或检测管，通过产酸、产气、颜色变化等反应，检测细菌的生 物化学性质，鉴定细菌的种属；也可借助生化测定试剂盒、细菌分析鉴定仪进行快速测定，并补充其它 的生理生化实验。 B.2.3 病理学检测 通过组织切片法，经取样、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片与贴片、染色与封固等技术处理后，进 行病理学显微观察，记录病征组织变化。 B.2.4 分子生物学方法检测 对纯培养细菌
13、菌株进行 16S rDNA分析。首先提取纯培养细菌菌株 DNA，测定其浓度，保证在 60-100 ng/L。以此为模板、利用 16S通用引物 (27f: 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 1492r: 5 -TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3 )进行 PCR扩增。 50 L的 PCR反应体系中含有： PreMix混合物 25 L，浓 度 20 mol/L引物各 1 L， DNA模板 1 L，加蒸馏水至 50 L体积。 PCR反应条件为： 94 预变性 4 min， 1 次； 94 30 s， 55 30 s， 72 1 min 40 s， 30个循环；最后
14、72 温育 6 min。 PCR产物通过测序获 得序列结果，将结果上传 NCBI GenBank数据库进行 Blast比对，选择同源性较高的细菌进行系统发育分 析，确定纯培养细菌菌株种属关系。 B.3 病原菌的致病性确定 DB37/T 41312020 7 将疑似刺参细菌性腐皮综合征病原菌分离纯化，获得纯培养菌株后，在健康刺参正常养殖状态下进 行疑似病原菌人工回感染实验，观察刺参感染后的情况是否与刺参细菌性腐皮综合征表述相符，同时再 次分离、纯化病原菌，通过形态学、生理生化、病理学和 16S rDNA分子生物学验证是否一致，若与原疑 似刺参细菌性腐皮综合征病原菌特性一致，即认为是细菌性腐皮综合
15、征致病菌。 B.4 编制诊断报告 诊断完成后应编制诊断报告。诊断报告参见表 B.1。 表 B.1 刺参细菌性腐皮综合征病原诊断报告 委托单位名称 委托单位地址 样品名称 检测类别 生产单位名称 检测项目 样品编号 样品规格 样品数量 样品状态 检测时间 检测环境条件 检测依据 所用主要仪器 抽样信息 抽样编号 抽样基数 抽样日期 抽样数量 抽样地点 抽样方法 检测 结论 形态学特 征 生理生化 性质 病理学特 征 DB37/T 41312020 8 表 B.1 刺参细菌性腐皮综合征病原诊断报告 （续） 检测结论 分子生物 学特征 诊断结果 细菌种属 ： 细菌是否具有致病性： 附件 ： 诊断图谱
16、 、 分析图谱等实验相关记录 。 注： （ 1）表格中所有栏目均应填写，没有内容时划 “”； （ 2）该报告仅对来样负责； （ 3）有异议申诉须在收到报告之日起十五天内提出； （ 4）报告如无检测专用章无效，涂改后作废； （ 5）复印件未加盖检测专用章（红章）无效； （ 6）报告无检测、审核、批准人签章无效。 （检测专用章） 签发日期： 年 月 日 DB37/T 41312020 9 C C 附 录 C （资料性附录） 现场调查表 现场调查表参见表 C.1。 表 C.1 现场调查表 调查来源 调查时间 调查人员 姓名 电话 单位 疾病发生地 情况 名称 ： 负责人姓名： 联系方式： 地址： 周
17、边环境： 疾病发生地养殖 条件情况 水质条件： (温度、盐度、酸碱度、溶氧、氨氮、浮游动植物、微量元素、光照 ) 饵料条件： 设施条件： (育苗池、养殖池、饵料池、供水系统、供热系统、供电系统，包括进排水 管道、底栖环境、附着基等 ) 其他： 养殖对象状况 体表： 体色： 肉刺状态： 体壁： 嘴部： 腹部： 运动状况： 发 病 情 况 流行情况 发病刺参规格： 发病数量： 发病水温： 发病 pH： 发病率： 死亡率： 最初发病时间： 开始死亡时间： 病程情况： 其他： 病征情况 急性发病死亡 体色正常 (棕色 /淡红色 /绿色 )或发白 体表溃烂 嘴部肿大或 溃烂 运动异常 体表肉刺完整或异常
18、 腹部溃烂或异常 其他： 诊断方法 及其依据 生物化学诊断 ： 病理学诊断 ： DB37/T 41312020 10 表 C.1 现场调查表 （续） 发 病 情 况 诊断方法 及其依据 分子生物学诊断： 发病范围 单个养殖车间 /池塘 单个养殖场 附近养殖场 附近乡镇 跨县、区、市 其他： 发 病 后 的 处 理 措 施 治疗措施 是否用药： 用药情况： 消毒剂： 抗生素： 其他措施： 治疗效果： 其他： 消毒或无 害化处理 情况 设施 /设备种类： 消毒剂： 消毒时间： 消毒次数： 污染物处理： 其他： 与疾病可 能发生的 关联 发病来源： 病情特征： 产品流向： 防控条件： 周边情况： 其
19、他： 近三年疾病发生 情况及预测 疾病情况： 预测情况： 处理情况： 采样送检情况 采样： 是 否 采样情况： 送检： 是 否 送检单位： 送检时间、批次： 采样组织： 份数： 送检情况： 检测实验室 无害化处理 兽医机构 其他： 疾病核实结论 是否疑似腐皮综合征： 是 否 其他： 病原菌结论 若是腐皮综合征病原菌，记录病原菌结论： 菌种： 形 态特征： 生物化学性质特征： 病理学特征： 分子生物学结论： DB37/T 41312020 11 表 C.1 现场调查表 （续） 产品流通情况 苗种来源 ： 养殖动物流动情况 ： 养殖产品 (苗种 )流通情况 ： 疑似传染源情况 养殖动物 或产品及其
20、他可疑的传染源的流通情况： 疾病发生监测区 情况 养殖水系情况 ： 封闭水系 开放水系 其他 近期气候异常情况 ： 疾病发生监控区 周围河流、湖泊： 有 无 疾病发生监控区排污情况 ： 有 无 疾病发生监控区有无易感水生动物 ： 有 无 分布情况 ： 其他 ： 周边情况 疾病 ： 有 无 疾病发生地 ： 发生时间 ： 发病简要说明 ： 发病动物来源情 况 来源地点 ： 联系方式 ： 发病动物去向情 况 有流通至其他地方 ： 是 否 简要说明 ： 调查情况 调查方法 ： 被调查人 ： 电话 ： 被调查单位 ： 电话 ： 注： 必要时要添加 文字材料作为说明或佐证 。 记录人签字 ： 核实人签字
21、： 单位盖章 年 月 日 DB37/T 41312020 12 D D 附 录 D （资料性附录） 追踪调查表 追踪调查表参见表 D.1。 表 D.1 追踪调查表 调查 来源 调查日期 调查人员 姓名 电话 单位 养殖场情况 监控点名称： 负责人姓名： 联系方式： 被监控点地址： 被监控点周边环境： 养殖条件情况 水质条件： (温度、盐度、酸碱度、溶氧、氨氮、浮游动植物、微量元素、光照 ) 饵料条件： 设施条件： (育苗池、养殖池、饵料池、供水系统、供热系统、供电系统，包括进排水 管道、底栖环境、附着基等 ) 其他： 养殖对象状况 体表： 体色： 肉刺状态： 体壁： 嘴部： 腹部： 运动状况：
22、 疾病情况 发病刺参规格： 发病数量： 发病水温： 发病 pH： 发病率： 死亡率： 典型症状： 急性发病死亡 体色正常 (棕色 /淡红色 /绿色 )或发白 体表溃烂 嘴部肿大或溃烂 运动异常 体表肉刺完整或异常 腹部平滑或异常 其他 ： 疾病发生地天气 状况 天气总体状况： 其他： 发病范围 单个养殖车间 /池塘 单个养殖场 附近养殖场 附近乡镇 跨县、区、市 其他 DB37/T 41312020 13 表 D.1 追踪调查表 （续） 感染源及感染途 径 感染源： 感染途径： 针对疾病的防治 措施 是否用药： 用药情况： 其他措施： 疾病发生后期的 处理 是否用药： 用药情况： 其他措施：
23、风险评估 养殖风险： 经济风险： 社会风险： 其他： 溯源条件 感染源： 感染途径及方向： 设施情况： 养殖动物自身情况： 环境情况： 饲料等外界给予情况： 渔药等使用情况： 其他： 产品流向 养殖刺参流动去向： 养殖刺参流动方式： 可能产生的影响： 其他： 近三年疾病发生 情况 处理情况： 防控情况： 防控条件 检测实验室 无害化处理 兽医机构 其他 监测技术方案情 况 监测技术 ： 监测建议 ： DB37/T 41312020 14 表 D.1 追踪调查表 （续） 防控措施 卫生管理 ： 密度管理 ： 水质管理： 其他 ： 采取 “ 预防 为主 ” 策略，使用微生态制剂或免疫增强剂 ， 提
24、高动物机体免疫力 。 记录人签字 ： 核实人签字 ： 单位盖章 年 月 日 DB37/T 41312020 15 E E 附 录 E （ 规范性附录） 监测技术方案 E.1 监测内容 监测内容包括： a) 养殖条件； b) 养殖水质； c) 养殖生态环境； d) 养殖饲料； e) 养殖渔药； f) 养殖废弃物。 E.2 监测要求及方法 E.2.1 要求 E.2.1.1 应遵循随机原则，取样比例一致、样品影响因素一致。 E.2.1.2 取样前应准备一份样品收集程序文件，包括样品收集前完成工作的核查表、收集样品所需要 的材料、随机抽样程序、样品分析点和其他影响样品收集的资料等等。 E.2.1.3
25、取样前应准备一个指定区域用以制备样品，保证无菌条件下操作。 E.2.1.4 收集样品前应准备好一切无菌材料，核查样品收集步骤、随机抽样程序等。 E.2.1.5 取样前应标注清楚样品袋。 E.2.1.6 进入取样区 域应换上不曾暴露病原区以外的工作服。 E.2.1.7 样品收集后应统一放置。 E.2.1.8 样品应有备份，检测后对保留样品进行仲裁。 E.2.1.9 检测方应有资质，配备专业设备及人员，流程体系运行良好，实行上岗责任制。 E.2.2 监测取样单 取样单应包括但不限于以下内容： a) 样品单应要有授权取样人签名与现场取样见证人签名； b) 取样的地点、日期与时间； c) 取样人员与见
26、证人的签名； d) 取样依据； e) 样品种类与编号、标注批次编码等信息； f) 取样批次标识码与标记编号； g) 取样批次对应的样品辨识号码； h) 按照样品特征进行不同形式保存，标识保存条件； i) 按照样品特征要求，标识样品送达目的地 ； j) 如有需要，标识清楚样品采集容器情况、环境条件及其他特殊信息； DB37/T 41312020 16 E.2.3 养殖条件 随时监测养殖设施环境条件，要求符合 DB37/T 442。 E.2.4 养殖对象 E.2.4.1 随时监测养殖对象健康状况，要求符合 GB/T 32756。 E.2.4.2 每次放苗前对苗种进行显微观察和微生物检测。用 0.9
27、 生理盐水反复冲洗刺参表皮组织， 分别用无菌解剖刀刮取体表粘液制作成水浸片后显微观察，是否有寄生虫感染；用平板计数法进行微生 物异养菌数量和弧菌数量检测，是否在正常数量范围内。 E.2.4.3 随时观察并记录刺参体色、体表有无损伤或大型寄生虫寄生、触手和口部组织有无异常等。 E.2.4.4 若发现问题，应及时将严重溃烂的个体拣出后掩埋或无害化处理，未发病和病轻的个体可用 氨基糖苷类抗菌素或土霉素等抗生素进行药浴和口服。 E.2.5 水质条件 E.2.5.1 符合 GB 11607、 NY 5052、 DB37/T 442。 E.2.5.2 应每天对水质进行监测。 E.2.5.3 水质样品采取“四角一中心”的五点位置进行采取，每点取样量为 2-5 L，将五组水样混合到 专用盛水器中备用。 E.2.5.4 水样保存不超过 2 h。 E.2.5.5 采样器一般是专用采水器，且不会对水样产生污染。 E.2.5.6 应尽量减少水样与采样器接触的时间。 E.2.5.7 部分水样通过便携式检测器立即进行温度、盐度、 pH、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐 等指标检测； 部分水样 5 min内加入福尔马林或刘哥氏液固定后通过显微观察法定性及
