1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4876.8 2020 代替 SN/T 11622002 DNA 条形码方法第 8 部分：菟丝子属 Method for DNA barcoding null Part 8: Cuscuta spp. 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 65.020.01 CCS B 16 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 4876.8 2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 SN/T 4876DNA 条形码方法为系列标准，已发布以下部
2、分： 第 1 部分：检疫性乳白蚁 第 2 部分：检疫性断眼天牛 第 3 部分：检疫性卷蛾 第 4 部分：检疫性高梁属 第 5 部分：曼陀罗属 第 6 部分：瘤背豆象属 第 7 部分：一品红亚属 第 8 部分：莬丝子属 本文件为 SN/T 4876 的第 8 部分 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国宁波海 关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和 国南京海关。 本文件主要起草人：于文涛、印丽萍、王念武、虞赟、傅怡宁、徐瑛、范晓虹、邵秀玲、吴海 荣、薛华杰、伏建国
3、。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 4876.8 2020 DNA 条形码方法菟丝子属 1范围 本文件规定了菟丝子属的 DNA 条形码检测鉴定方法。 本文件适用于国境口岸开展菟丝子属分子鉴定的植物检疫实验室。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 1385菟丝子属的检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA 条形码DNA barcode 一段短的、标准化的基因片段，
4、用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分 化，并容易进行 PCR 扩增。DNA 条形码技术主要用于物种识别和新种发现。 3.2 凭证标本voucher specimen 一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本， 它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本记录的存档信息应具 有追溯性。凭证标本的保存非常重要，是 DNA 条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、 采集信息、鉴定信息，用于复核。 3.3 核基因组核糖体 DNAnuclear ribosome DNA；nrDNA 真核生物细胞核染色体所包含的全
5、部遗传信息，即碱基对，有别于诸如叶绿体和线粒体的质体 DNA，以及黏粒及质粒等其他 DNA 存在形式。 3.4 叶绿体 DNAchloroplast DNA；cpDNA 存在于叶绿体内的 DNA。高等植物叶绿体的 DNA 为双链共价闭合环状分子，其长度因生物种类 而不同，其大小在 120 kb 到 217 kb 之间，相当于噬菌体基因组的大小。 3.5 内部转录间隔区internal transcribed spacer；ITS 在真核生物核核糖体 DNA 中，18S rRNA 和 28S rRNA 基因间隔序列称为内转录间隔区。内转 录间隔区所在的核糖体基因组序列从 5 null 到3 nu
6、ll 依次为：外部转录间隔区（external transcribed spacer， ETS）、18S 基因、内部转录间隔区 1（ITS1）、5.8S 基因、内部转录间隔区 2 （ITS2）、28S 基因和基因 间隔序列（intergenic spacer，IGS）。即，内转录间隔区包含 ITS1、5.8S 基因和 ITS2。核糖体 RNA 中 以正式出版文本为准 2 SN/T 4876.8 2020 的 18S、5.8S 和 28S 的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区 ITS1 和 ITS2 作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽
7、的系统学分析 所需要的可遗传性状。 3.6 1,5 - 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因RubisCo_large ； rbcL 1,5 - 二磷酸核酮糖羧化酶（ RubisCo）是一种具有羧化和加氧双重功能的酶，在光合作用和光呼 吸中都起着重要的作用。RubisCo 酶由 16 个亚基组成，包括 8 个大亚基和 8 个小亚基。其中大亚基 基因（rbcL）由叶绿体基因组编码。 4菟丝子属植物基本信息 中文名：菟丝子属 学名： Cuscuta spp. 分类地位：被子植物门（Magnoliophyta），木兰纲（Magnoliatae），茄目（Solanales），旋花科 （Convolvulace
8、ae） 菟丝子属植物为寄生草本，无根，全体不被毛。茎缠绕，细长，线形，黄色或红色，不为绿色， 借助吸器固着寄主。无叶，或退化成小的鳞片。花小，白色或淡红色，无梗或有短梗，成穗状、总 状或簇生成头状的花序；苞片小或无；花 54 出数；萼片近于等大，基部或多或少连合；花冠管状、 壶状、球形或钟状，在花冠管内面基部雄蕊之下具有边缘分裂或流苏状的鳞片；雄蕊着生于花冠喉部 或花冠裂片相邻处，通常稍微伸出，具短的花丝及内向的花药；花粉粒椭圆形，无刺；子房 2 室，每 室 2 胚珠，花柱 2，完全分离或多少连合，柱头球形或伸长。蒴果球形或卵形，有时稍肉质，周裂或 不规则破裂。种子 14，无毛；胚在肉质的胚乳
9、之中，线状，成圆盘形弯曲或螺旋状，无子叶或稀 具细小的鳞片状的遗痕。本属植物约 170 种，广泛分布于全世界暖温带，主产美洲。 菟丝子属植物易随寄主及其产品传播，其为可造成严重经济损失又难以防除的恶性杂草，因此 世界上许多国家把其列为禁止或限制输入的有害生物。 5总体原则 本标准建立的方法不应完全取代形态学鉴定方法，而应与形态学鉴定方法 SN/T 1385 互为补充， 相互佐证。 6方法原理 根据菟丝子属的 ITS 序列和 rbcL 基因特征，应用 DNA 条形码技术对菟丝子属植物进行筛查鉴定。 7仪器用具和试剂 7.1仪器及用具 常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪
10、、高速冷冻离心机、生物安全 柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平（1/10 000 g）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯 水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器（2 L、10 L、20 L、100 L、200 L、 1 000 L）、离心管（2 mL）、PCR 反应管（0.2 mL、0.5 mL）。 以正式出版文本为准 3 SN/T 4876.8 2020 7.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷 三磷酸（dNTPs）、 Taq 聚合酶、10PCR 缓冲液。CTA
11、B 法提取试剂（参见附录 A 中 A.1）。 8筛查鉴定方法 8.1样品的处理 使用形态学方法无法完全判定的疑似菟丝子属植物及其近似属的植物材料，将需要提取 DNA 的 植物材料（种子为 12 粒，硅胶干燥的茎为 10 mg），放入 2 mL 的 EP 管中，每个管内加 2 粒钢珠， 加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min（30 r/s）。 8.2核酸的制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的 CTAB 法方法参见附录 A 中 A.2。 PCR 级 DNA 溶液的 OD 260 /OD 280 比值应为 1.71.9。 8.3DNA
12、条形码片段扩增 利用 ITS 序列和 rbcL 基因的通用引物进行 ITS 序列和 rbcL 基因扩增，引物序列、反应程序和反 应体系见附录 B。 8.4PCR 产物的检测 取 PCR 产物 5 L，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 ITS 引物扩增可获得约 600 bp 的扩增片段，rbcL 引物扩增可获得约 700 bp 的扩增片段。 8.5测序与序列处理 取剩余的 PCR 扩增产物 45 L，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用 DNA 产物纯化试剂 盒纯化并测序。测序引物与 PCR 扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对
13、比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两 端测序质量 Q 值小于 20 的序列去除。 9结果判定 9.1中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统判定 登录中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统（ 导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输入FASTA格式 （或纯文本格式） 序列后，点击“提交鉴定”， 系统进行 BLAST 后，自动生成鉴定结果。如相似度最高的 10 条序列为菟丝子属序列，且最大相似度 在 98% 以上，可明确判定为菟丝子属（参见附录 C）。 9.2植物有害生物检疫鉴定系统判定 登录植物有害生物检疫鉴定系统（ 析软件对查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该
14、类群鉴定特征且相似度为 以正式出版文本为准 4 SN/T 4876.8 2020 100% 的物种判定为该物种。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法见附录 D。 9.3国际通用数据库判定 登录 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在 BLAST 结果中 查看序列相似性最高（Max ident or similarity）的物种，一般为与查询序列最接近的物种。菟丝子属常 见近似种基因序列表信息参见附录 E。 10凭证标本与原始数据保存 10.1凭证标本保存 采集到的标本应保存在干燥硅胶中。货物来源，菟丝子
15、寄主，采集时间、地点及采集者，保存期 为 1 年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。 10.2原始数据保存 样品检测结束后，其原始记录单（应包括 DNA 序列及测序峰图等内容）和检验报告或证书应归 档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 以正式出版文本为准 5 SN/T 4876.8 2020 附录A （资料性） DNA 提取方法（改良 CTAB 法） A.1试剂 A.1.1CTAB提取液：CTAB 20 g/L，氯化钠1.4 mol/L，Tris 0.1 mol/L（pH 8.0），EDTA 0.02 mol/L（pH 8.0）， 高压灭菌备用。 A.1
16、.2三氯甲烷异戊醇：体积分数 241。 A.1.350TAE 缓冲液：242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），充分溶解混匀 后，加水定容至 1 L，高压灭菌备用。 A.1.410 加样缓冲液：0.25溴酚蓝，40% 蔗糖。 A.2提取步骤 在含植物粉末的2 mL离心管中加入已预热至 65 的600 L CTAB提取液，充分振荡混匀；65 水浴 30 min，不时颠倒混匀；10 000 r/min 离心 5 min，取上清，等体积三氯甲烷 - 异戊醇（三氯甲烷 : 异戊醇 =24 : 1）抽提一次；取上清，再加入等体积异丙醇，4
17、沉淀 10 min 以上，然后 12 000 r/min 离心10 min，弃上清；70%乙醇洗涤1次2次，晾干后，加入20 L TE缓冲液溶解沉淀，保存于-20 冰箱冷冻备用。 以正式出版文本为准 6 SN/T 4876.8 2020 附录B （规范性） 序列扩增引物及流程 B.1引物序列及反应程序 引物序列及反应程序见表 B.1。 表 B.1引物序列及反应程序 引物 引物序列 反应程序 ITS Forward ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 94 , 5 min；35（94 , 30 s； 56 , 30 s；72 , 30 s）；72 , 7 min
18、 Reverse ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC rbcL Forward rbcL-1F ATG TCA CCA CAA ACA GAA ACT 94 , 5 min；35（94 , 30 s； 50 , 30 s；72 , 30 s）；72 , 7 min Reverse rbcl-724R CGG TAC CAG CGT GAA TAT GAT B.2PCR 反应体系 PCR 反应体系见表 B.2。 表 B.2PCR 反应体系 成分 储备液浓度 50 L 反应体系加样体积（ L） dNTP 混合物（各 10 mmol/mL） 2.5 mmol/L 4.0
19、10PCR 缓冲液（含 Mg2+） 5.0 正向引物 10 pmol/L 2.0 反向引物 10 pmol/L 2.0 Taq 酶 5 U/L 0.5 DNA 模板 0.3 g/L 6 g/L 2.0 ddH 2 O 补至 50 L 同时要设置阳性对照，空白对照（以 ddH 2 O 代替 DNA 样品），每个样品重复 2 次。可用商品化 的 PCR Premix。 以正式出版文本为准 7 SN/T 4876.8 2020 附录C （资料性） 中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统操作方法 中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统操作方法见图 C.1 和图 C.2。 图 C.1物种识别页面
20、 图 C.2鉴定结果页面 以正式出版文本为准 8 SN/T 4876.8 2020 附录D （规范性） 植物有害生物检疫鉴定系统操作方法 登录植物有害生物检疫鉴定系统（ 在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对”，软件会在数据库范围内比对，输出物种 鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果” 里，点击“开始对比”，将符合该类群鉴定特征且相似度为 100% 的物种判定为该未知种。 以南方菟丝子 Cuscuta australis 为例，在“输入比对的序列”窗口中粘贴 rbcL 基因片段，点击“比 对”，相似性最高的条码序列对应分类阶元为菟
21、丝子属 Cuscuta，相似性为 100%。在这一栏点击“开 始对比”，相似度为 100% 的序列对应物种为南方菟丝子 Cuscuta australis，即可判定查询序列为该物 种。 以正式出版文本为准 9 SN/T 4876.8 2020 附录E （资料性） 菟丝子属常见种 ITS 和 rbcL 序列 GenBank 登录号 菟丝子属常见种 ITS 和 rbcL 序列 GenBank 登录号见表 E.1。 表 E.1菟丝子属常见种 ITS 和 rbcL 序列 Gen Bank 登录号 序号 中文名 学名 ITS rbcL 1 五角菟丝子 Cuscuta pentagona KX430874
22、 KX430875 KX430876 KX430877 KX430878 KX430892 KX430894 KX430899 KX430900 KX430901 2 田野菟丝子 Cuscuta campestris KX430863 KX430864 KX430865 KX430866 KX430867 KX430886 KX430887 KX430888 KX430889 KX430890 3 南方菟丝子 Cuscuta australis KX430858 KX430859 KX430860 KX430861 KX430862 KX430879 KX430880 KX430881 KX4
23、30882 KX430885 4 菟丝子 Cuscuta chinensis KX430868 KX430869 KX430870 KX430871 KX430872 KX430873 KX430883 KX430884 KX430891 KX430893 KX430895 KX430896 KX430897 KX430898 5 杯花菟丝子 Cuscuta applanata EF194603 EF194604 EF194605 EU330272 KJ436622 KJ436623 6 小菟丝子 Cuscuta liliputana EU288362 EU288363 EU288364 KJ
24、436675 KJ436676 KJ436677 7 太平洋菟丝子 Cuscuta pacifica GQ254887 GQ254888 GQ254889 GQ254883 GQ254884 8 檀香山菟丝子 Cuscuta sandwichiana EU288356 EU288357 EU288358 AY101057 KJ436712 9 伞形菟丝子 Cuscuta umbellata HM748903 HM748904 HM748905 KJ436726 KJ436727 10 威氏菟丝子 Cuscuta veatchii EU288353 EU288354 EU288355 KJ436
25、730 KJ436731 以正式出版文本为准 10 SN/T 4876.8 2020 参 考 文 献 1方瑞征 , 黄素华 . 中国植物志 : 第 64 卷 1 分册 M. 北京 : 科学出版社 . 1979:143-148. 2HEBERT P D N, CYWINSKA A, BALL S L, et al. Biological identifications through DNA barcodesJ. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, 2003, 270 (1512): 313-321. 3LAHAYE R,
26、VAN DER BANK M, BOGARIN D, et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspotsJ. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2008, 105(8): 2923-2928. 4SCHINDEL D E, MILLER S E. DNA barcoding, a useful tool for taxonomistsJ. Nature, 2005, 435: 17. 5TABERLET P, GIELLY L, PAUTOU G, BOUVET
27、 J. Universal primers for amplification of three non- coding regions of chloroplast DNAJ. Plant Molecular Biology, 1991, 17(5): 1105-1109. 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 26 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175110 定价 18.00 元 DNA 条形码方法 菟丝子属 行 业 标 准 SN/T 4876.82020 * * * SN/T 4876.8 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
