1、HG 3616-1999 前言本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌原粉的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌生产提供了统一的技术依据。本标准的附录A是提示的附录，附录B是标准的附录。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位:中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位:湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人，:X1J丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王缔文。1156 中华人民共和国化工行业标
2、准HG 36161999 苏云金杆菌原粉Bacillus thuringiensis technical 苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis , B. t. )是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为1300000 1 范围本标准规定了苏云金杆菌原粉的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于防治鳞翅目害虫的苏云金杆菌原粉。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版
3、本的可能性。GB/T 12501989 极限数值的表示方法和判定方法GB/T 16001979(1989) 农药水分测定方法GB/T 16011993 农药pH值的测定方法GB/T 16041995 商品农药验收规则GB/T 1605一1979(1989)商品农药采样方法GB 3796一1983农药包装通则GB/T 161501995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3 要求3. 1 外观g灰白色至棕褐色粉未。3. 2 苏云金杆菌原粉应符合表1要求。表1苏云金杆菌原粉控制项目指标指标项目一等晶毒章蛋白，%，飞/ 7.0 毒力效价(PxIU!mgHa IU!mg) 二注50000 pH值5.5-
4、7.0 水分，.%运三6.0 细度.45m，%，二注98 注，PX和Ha分别为小菜蛐(Plutellaxylostella)和棉铃虫(Helioth四armtgera)缩写.国东石油和化学工业周1999-06-16批准合格晶6.0 40000 2000- 06 -01实施1157 HG 3616-1999 4 试验方法除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4. 1 抽样按照GB/T1605-1979(989)中原粉采样进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少于100g 0 4.2 鉴别试验当用生物测定法评价产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二炕基硫酸
5、饷聚丙烯瞰胶凝胶电泳CSOS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，同时测定其含量是否符合3.2指标的规定。4.3 毒素蛋白含量测定方法毒素蛋白含量可以用SOS-PAGE扫描法和SOS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1 SOS-PAGE扫描法(仲裁法)4.3.1.1 方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴泡晶体.使其降解为毒素蛋白.然后通过SOS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4. 3. 1.2
6、仪器、设备电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积145mmX 100 mm(l. 5 mm、12孔样品槽模具)。高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:10000 r/min. 分析天平:精确至O.000 1 g。4. 3. 1. 3 试剂和溶液过硫酸镀(AP)。十二烧基硫酸纳(SOS)。四甲基乙二胶(TEMEO)。氮氧化销。30%丙烯酿胶z称取丙烯酷胶30g.亚甲基双丙烯酿胶(原称=甲叉双丙烯戳胶)0.8 g，溶于100mL 蒸惰水中，过滤，于4C暗处贮存备用。1 mol/L, pH8. 8三短基甲基氨基甲烧HCl缓冲液s称取三资基甲基氨基甲烧30.25 g溶
7、于蒸馆水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馆水定容至250mL, 1 mol/L、pH6.8三经基甲基氨基甲烧-HCl缓冲液.称取二短基甲基氨基甲烧12.10 g溶于蒸馆水中，用浓盐酸调至pH6.8，用蒸馈水定容至100mL。电极缓冲液g称取三强基甲基氨基甲烧3.03 g.甘氨酸14.42g，十二烧基硫酸纳1日，用水溶解并定容至1000 mL。3X样品稀释液:1 mol/L、pH6.8三起基甲基氨基甲烧-HCl18.75 mL.十二烧基硫酸纳6g，甘油30 mL.疏基乙醇15mL.少许澳盼蓝.用蒸锢水定容至100mL. 染色液:称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501 g.加入甲醇450mL.冰乙酸
8、100mL.蒸馆水450mL.溶解过滤后使用。脱色液:量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸馆水定容至1000 mL。1158 HG 3616-1999 漂洗液z量取元水乙醇30mL.冰乙酸10mL.蒸馆水60mL.混合均匀后使用。毒素蛋白标样z毒素蛋白(相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4. 3. 1.4 试样处理称取标样、试样各20mg(准确至0.1mg).移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加人0.55 mol/L氢氧化销榕液0.45mL(使氮氧化锅溶液的终浓度为0.1mol/L).放置约5min，再加人3X样品稀释液1.30 mL.使最终体积为3.75mL.于
9、100C沸水中煮6min，离心(2000 r/min)10 min 后取上层清液，以备电泳上样。4. 3. 1. 5 SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酷胶凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A(提示的附录。b)上样取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯酿胶凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14L(毒素蛋白含量约为3-7g).作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5阅)，加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。c)电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到120V.继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳
10、，取出胶板，在7.5%(体积百分数)乙酸中浸泡30min。d)染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜.e)脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱包液，于3TC下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。4.3.1.6 测定胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nmo 样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。X 隅，vz一.X 100 m2v 1 式中:ml一一从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量，用m，一-2mL稀释液中样品的质量，mg;V1 样品最终定容体积.mL(
11、3.75 mL) , V，一一注人凝胶上样孔的样晶体积，L。4.3.1.7 允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2 SDS-PAGE洗脱比色法4. 3. 2. 1 方法提要. ( 1 ) 用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴抱晶体，使其降解为原毒素，然后通过SDS-PAGE.依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，测定吸光度。4.3.2.2 仪器、设备分光光度计.其他同4.3. 1. 20 4.3.2.3 试剂和溶液毗睫1159 其他同4.3. 1. 3。4. 3- 2.4 试样处理同4.3.1.4。4. 3. 2. 5 SDS
12、-PAGE分离毒素蛋白a)帘j备8%10%聚丙烯酷胶凝胶同4.3.1.5.)。b)上样HG 3616 1999 取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15、20、30、40、50L(毒素蛋白含量约为7.5 25g)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为15g)，加入到上样孔中.注入电极缓冲液后，接通电Moc)电泳同4.3. 1. 5c)。d)染色同4.3.1.5d)oe)脱色同4.3. 1. 5e)。4.3.2.6 测定用手术刀刮下待测区带，放人玻璃试管中，再加25%毗院(体积分数)3. O. mL.于37C下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考克斯亮蓝(CBB)R-25日
13、，平衡后用分光光度计.以25%毗院为参比，于605nm下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量.4.3.2.7 允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.4 毒力效价的测定接附录B(标准的附录)进行.4.5 pH值的测定按GB/T1601测定。4.6 细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定。4. 7 水分的测定按GB/T1600-1979(1989)中共沸蒸馆法进行测定.5 检验规则应符合GB/T1604有关规定.极限数值按GB/T1250处理.6 标志、标签、包装、贮运6. 1 产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号，6
14、.2 原粉主要采用塑料袋包装，密封.6.3 贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处。6.4 运输时，注意轻放，防止损坏.6.5 保证期:在正常贮运条件下，原粉质量保证期从生产日期算起为二年，产品出厂时毒力效价和毒素蛋白含量不低于32指标，两年内产品毒力效价和毒素蛋白含量均不低于3.2指标的60%。1160 A1串i板HG 3616 1999 附录A(提示的附录)电泳胶的制备本实验选用板状电泳。具体操作根据实验室条件而定。基本操作大体上是根据电泳槽高矮大小，选择两块大小一样的玻璃板，其中一块一端带有23cm高的凹槽。两块玻璃板洗净干燥后，在无凹槽的玻璃板两边各放一条间隙条(塑料条、胶条都可以，其
15、宽度、厚度根据需要而定)。然后放上带凹槽的玻璃板，用夹子将两块玻璃板固定，这样两块玻璃板之间就形成了一定的问隙。形成的间隙下端应该封闭，以防灌人的胶液漏出。一般用胶纸条封闭，待灌入的胶凝固后，再撕去胶纸s或用1%1.5%浓度的琼脂封闭，方法是:在琼脂中加入电极缓冲液或蒸馈水，在沸水浴中加热溶解，将带有间隙的玻璃板装置，垂直放在一个高3cm、宽3cm、比玻璃板宽而长的一个小槽内(商品电泳槽有配套装置)，趁热将溶解的琼脂胶灌入小槽内，待冷却后取出玻璃板装置，下端即封严，可进行灌注聚丙烯酷胶胶液。A2 制备分离胶从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按表A1先配制分离胶。本试验中分离胶浓度为10%。将胶
16、液配好、混匀后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高的蒸馆水，加蒸铺水时通常顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约2030min左右使之凝聚.此时，在凝胶和蒸馈水之间可以看到很清晰的一条界面。然后吸出胶面上的蒸馆水。A3 制备浓缩胶其用量根据实际情况而定，制备方法按表A1。表A1SDS-PAGE凝胶的配方贮备液分离胶浓缩胶30%丙烯酷胶10 mL 3.4 mL 1 mol/L、pH8.8二是基甲基氨基甲烧-HCl13 mL 1 mol/L、pH6.8二是基甲基氨基甲烧HCl2.5 mL 蒸锢水11.6 mL 14.0 mL 10
17、%十二烧基硫酸锵0.35 mL 0.20 mL 10%过硫酸镀0.23 mL 0.20 mL 四甲基乙二胶23L 20L 混合上述溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，而后倒出。然后把余下的胶液注入玻璃板间隙，使胶液面与菠璃板凹槽处平齐，而后插入梳子，在室温放置2030min，浓缩胶即可凝聚。凝聚后，慢慢取出梳子，取时应防止把胶孔弄破。取出梳子后，在形成的胶孔中加入蒸馆水，冲洗未凝聚的丙烯酿胶等，倒出孔中蒸馆水，再加入电极缓冲液。将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳槽下端的贮液槽中
18、也加入电极缓冲液。1161 HG 3616-1999 附录B(标准的附录)毒力效价的测定B1 毒力效价测定方法之一用小菜峨(PlutellaxylostellaJil试虫的测定方法(伸裁法)B1.1 试剂或材料标准品.CS-95.H3.b效价20000 IU /mg. 小菜峨幼虫.Plutellaxylostella。食用菜籽泊。酵母粉g工业用。维生素C.医用，分析纯。琼脂粉E凝胶强度大于300g/cm。磷酸氢二饵g分析纯。磷酸二氢梆z分析纯。聚山梨酶80:粘度3.5XIO-5. 5XIO- m/s. 菜叶粉z甘蓝型油菜叶.80C烘干，磨碎，过80目筛。f.糖g分析纯。纤维素粉CF-ll.氢氧
19、化饵z分析纯。氯化销z分析纯。15%尼泊金2对疑基苯甲酸甲醋(化学纯)溶于95%乙醇。10%甲隆溶液g甲窿(分析纯)榕于蒸馆水。干酷素溶液g干酷素5mm, 注射器，50mL。标本缸。恒温培养箱。82.3 测定步骤82. 3. 1 饲料准备饲料配方g酵母粉12g、黄豆粉24g、维生素C1. 5 g、苯甲酸锅。.42g、36%乙酸3.9mL、蒸愧水300mL。将黄豆粉、酵母楠、维生素C、苯甲酸销和36%乙酸放入大烧杯内，加100mL蒸馆水湿润，另将余下200mL蒸锢水加入琼脂粉内，在微波炉上加热至沸腾.使琼脂完全熔化，取出冷却至70C，即与其他成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌1min，迅速移至6W
20、C水浴锅中加盖保温。82. 3. 2 感染液的配制称100.0-150.0tng可湿性精Jl!J样品，至盛苟玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液100mL , 浸泡10min，在振荡器上振荡1min ep成母液。或将悬浮剂样品充分振荡均匀后，吸取1.00 mL，至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液99mL，浸泡10min，在振荡器上震荡1rnin即成母液，于分1164 HG 3616-1999 析天平上称取150.0300. 0 mg标准晶精确到0.1mg)，如上法制成母液。将样品和标准品母液用磷酸缓冲液以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准晶至少各稀释5个浓度，并设一缓冲溶液作对照，
21、每一浓度感染液吸取3mL至50mL小烧杯内待用，对照吸取3mL磷酸缓冲液。B2. 3. 3 饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器离速搅拌0.5 min，迅速倒入组织培养盘上各小孔中(倒人量不要求一致，以铺满孔底为准)，凝固待用。B2. 3. 4 接虫liI.I染于2630C室温下，将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内抖人直径20cm的标本缸中，静待数分钟选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫。每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖立放于30C恒温培养箱内培养72h。B2.4 结果检查和统计分析用肉眼或放大镜检查死、活虫数.以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式(B1)计算校正死亡率。对照死亡率在6%以下不用校正，6%15%之间儒校正，大于15%则测定无效.将浓度换算成对数值，死亡率或校E死亡率换算成机率值，用最小二乘法分别求出标准品和样品的LC50，按式(B2)计算毒力效价。B2.5 允许差毒力测定方法的允许相对偏差要求与B1.5相同.1165
