1、HG 3618-1999 前主主I=t 本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位:中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位2湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人，J丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王缔文。1172 中华人民共和国化工行业标准HG 3618-1999 苏云盒杆菌悬
2、浮荆Bacillus thuringiensis suspension concentrate 苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis , B. t. )是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000，1 范围本标准规定了苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂制成的苏云金杆菌悬浮剂，主要用于防治鳞翅目害虫。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的
3、各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 1250-1989 极限数值的表示方法和判定方法GB/T 1601-1993 农药pH值的测定方法GB/T 1604-1995 商品农药验收规则GB/T 1605-1979(989) 商品农药采样方法GB 3796-1983 农药包装通则GB/T 14825-1993 农药可湿性粉剂悬浮率测定方法GB/T 16150-1995 农药精剂、可湿性粉剂细度测定方法HG 3617-1999 苏云金杆菌原粉3 要求3. 1 外观z棕黄色至褐色悬浮液体。3- 2 苏云金杆菌悬浮剂还应符合表1要求。表1苏云金抨菌悬浮剂控制项目指标指标项目8000IU/L
4、4 000 IU/L 毒章蛋白，%二主0.8 0.4 毒力效价(PXIU/LJHa IU/pLJ) / 、8000 4000 pH值范围4.5-6.5 细度050m).%二主98 最浮率(有效成分)，% 二三80 注:PX和Ha分别为小菜峨(PlutellaxylosteUa)和棉铃虫(Heliothisarmigera)的箱写.国凉石油和化学工业周1999-06-16批准2000IU/L 0.2 2000 却00-06-01实施1173 HG 3618-1999 4 试验方法除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4. 1 抽样按照GB/T1605-1979(1989)中第
5、四章乳剂和液体状态的采样进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量应不少于250mL. 4.2 鉴别试验当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烧基硫酸锅聚丙烯酷胶凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，并同时测定毒素蛋白含量是否符合3.2指标的规定。4.3 毒素蛋白含量的测定毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4. 3- 1 SDS-PAGE扫描法(仲裁法)4.3.1.1 方法提要用碱性熔液处理苏云金杆菌悬
6、浮剂伴于国晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4.3.1.2 仪器、设备电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积145mmX 100 mm(l. 5 mm、12孔样品槽模具)。高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:10000 r/min. 分析天平z精确至O.000 1 g. 4. 3- 1.3 试剂和溶液过硫酸镀(AP)。十二烧基硫酸销(SDS)。四甲基乙二胶(TEMED)。氢氧化锅。30%丙烯瞰胶称取丙燃酸胶30g，亚甲基双丙烯
7、酸胶(原称甲叉双丙烯酷胶)0.8 g，溶于100mL 蒸馆水中，过滤，于4C暗处贮存备用。1 mol/L、pH8.8三起基甲基氨基甲烧-HCl缓冲液s称取三短基甲基氨基甲烧30.25 g溶于蒸馆水中.用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馆水定容至250mL. 1 mol/L、pH6.8三援基甲基氨基甲烧-HCl缓冲液g称取三经基甲基氨基甲烧12.10g溶于蒸偏水中，用浓盐酸调至pH6.8.用蒸偏水定容至100mL. 电极缓冲液.称取三费基甲基氨基甲烧3.03 g，甘氨酸14.42g，十二烧基硫酸销1g，用蒸馆水溶解并定容至1000 mL. 3X样品稀释液:1 mol/L、pH6.8三短基甲基氨基甲烧-
8、HCl18. 75 mL，十二烧基硫酸销6g，甘汹30 mL，疏基乙醇15mL，少许澳盼蓝，用蒸馆水定容至100mL. 染色液z称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501 g，加入甲醇450mL，冰乙酸100mL.蒸馆水450mL，溶解过滤后使用。脱色液量取甲醇100mL.冰乙酸35mL，用蒸馆水定容至1000 mL. 1174 HG 3618-1999 漂洗液g量取元水乙醇30mL，冰乙酸10mL，蒸f菌水60mL，混合均匀后使用。毒素蛋白标样s毒素蛋白(相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4. 3- 1.4 试样处理称取标样20mg(准确至O.1 mg)，移至5mL离心管中，加2m
9、L水充分悬浮。量取待测试样10mL，准确称量后，用燕馆水定容至100mL，充分摇匀后取2mL稀释液，移至5 mL离心管中囚在上述2mL试样溶液中加入0.55moI/L氢氧化锁溶液0.45mL(使氢氧化纳溶液的终浓度为0.1 mol/L) ，放置约5min，再加人3X样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于100C沸蒸馆水中煮6min，离心(2000r/min)10 min后取上层清液，以备电泳上样。4.3.1.5 SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酿胶凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616-1999 附录A(提示的附录)。b)上样取上述标样溶液上层清液，
10、于聚丙烯就胶凝胶的上样孔中分别上样5、8、10、12、14L(毒素蛋白含量约为3-7g)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5g)，加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。c)电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积百分数)的乙酸中浸泡30mino d)染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e)脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝跤，然后加入脱色液，于37C下加热使其脱色.更换几次脱色液，直至背景清晰为止。4. 3. 1
11、-6 测定胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nm。样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。x m1v z-4之X100 mzv 1 式中:ml 从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量，g;m, 2 mL稀精液中样品的质量，mg，V1一一样品最终定容体积，mL(3.75 mL) I V, 注入凝胶上样孔的样晶体积，L。4.3.1.7 允许差取其算术平均值为测定结果。再次平行测定结果相对偏差小于等予8%。4. 3- 2 SDS-PAGE洗脱比色法4.3.2. 方法提要( 1 ) 用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴抱
12、晶体，使其降解为霉素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割跤，洗脱，测定吸光度。4.3.2.2 仪器分光光度计。其他同4.3.1.201175 4.3.2.3 试剂和溶液毗呢。其他同4.3.1.304.3.2.4 试样处理同4.3. L 4。4. 3- 2. 5 SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%10%聚丙烯酷胶凝胶同4.3.1.5a)。b)上样HG 3618-1999 取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上佯15、20、30、40、50L(毒素蛋白含量约为7.525 g).作为标准曲线，再取一定体权的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量
13、约为15g).加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。c)电泳同4.3.L 5c。d)染色同4.3. 1. 5d)。e)脱色同4.3.1.50)。4. 3- 2.6 测定用手术刀刮下待测区带，放于玻璃试管中，再加25%毗睫(体积百分数)3.0mL.于3TC下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考马斯亮蓝(CBB)R-250.平衡后用分光光度计，以25%毗晓为参比，于605nm 下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量。4.3.2.7 允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.4 毒力效价的测定按HG3616-1999附录B(标准的附录)进行。4.5 pH值的测定
14、按GB/T1601进行.4.6 悬浮率测定4. 6. 1 测定步骤样品摇匀后取5.00mL(精确到0.01mL).于100mL三角菠璃瓶中，加人标准硬水100mL.用手左右振荡50次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量筒中，用标准硬水稀释到250mL.按GB/T148251993中3.1进行。4.6.2 计算悬浮率(y)按式(2)进行计算zy 旦五二二垒2C 式中:C一配置悬浮液所取试样的毒力效价.IU，Q 留在量筒底部的25mL悬浮液的毒力效价.IU0 4.6.3 允许差二次重复测定结果之差不得超过10%。4. 7 细度的测定吸20.00mL试样(准确至0.01mL).按GB/T16150-1995中2.2进行。1176 . ( 2 ) HG 3618-1999 5 检验规则应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理。6 标志、标签、包装、贮运6. 1 产品包装应符合GB3796规定，并应注明所用标准编号。6.2 悬浮剂产品主要采用1L塑料壶包装，壶有内外盖，不泄漏。6.3 贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处。6.4 运输时，注意轻放，防止损坏.6.5 保证期z在正常贮运条件下，悬浮剂的质量保证期从生产日期算起为一年半，本产品出厂时毒力效价且蛋白含量不低于3.2指标，年半内毒力效价与蛋白含量均不低于3.2指标的60%。4度1177
