1、 ICS 67. CCS X 0 安 禽 蛋 Determ 2021-0 050 4 徽 蛋 中 替 ination o 9-03 发 布 徽 替 米 考 f tilmicos 布 安 省 考 星 残 in residue 安 徽省市 场 地 残 留 的 谱 法 s in egg- h 场 监督管 理 方 的 测 定 法 igh perfo 理 局 发 方 DB 定 高 rmance li 发 布 34 标 34/T 399 高 效 液 quid chro 2021- 准 1 2021 液 相 色 matograp 10-03 实 准 色 hy 实 施 DB34/T 39912021 I 前言
2、 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省兽药饲料监察所提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽安丰堂动物药业有限公司、安徽省兽药饲料监察所、利辛县双飞养殖专业合 作社、安徽省动物卫生监督所、 安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省农科院畜牧兽医研究所、桐城 市畜牧兽医管理中心、宣州区畜牧兽医管理局。 本文件主要起草人：张莉、刘红云、张士卿、苗文萍、章天霞、蔡一杰、郑举、吴蕾、李珲、王雨 霜、刘文文、王群、马瑞钰、丁常宏、杜
3、腾飞。 DB34/T 39912021 1 禽蛋中替米考星残留的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了禽蛋中替米考星残留检测的试样制备及高效液相检测方法。 本文件适用于禽蛋中替米考星的残留测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的替米考星加乙腈经涡旋匀浆后离心取上清液，正己烷液液分配去脂，固相萃取柱
4、净化，旋 转蒸发浓缩，经色谱柱梯度洗脱分离，用紫外检测器检测，以保留时间进行定性，外标法定量。 5 试剂和材料 5.1 用水符合 GB/T 6682 中一级用水的规定。 5.2 甲醇：色谱纯。 5.3 乙腈：色谱纯。 5.4 正己烷：分析纯。 5.5 无水硫酸钠：分析纯。 5.6 磷酸：分析纯。 5.7 二丁胺：分析纯。 5.8 氢氧化钠：分析纯。 5.9 替米考星对照品： 95.0。 5.10 固相萃取柱：HLB（6 mL，200 mg）或同等柱效。 5.11 替米考星标准溶液的制备：取替米考星对照品 25.0 mg，精密称定，置 25 mL 容量瓶中，加乙 腈制成每 1 mL 中含 1 m
5、g 的溶液，精密量取 5 mL，置 25 mL 量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀， 制成 0.2 mg/mL 的标准储备液。在试验中用磷酸溶液配置成不同浓度的标准工作液，现配现用。 DB34/T 39912021 2 5.12 磷酸溶液的配制：取水 900 mL，加磷酸 5.71 g，用 12.5 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 2.5 0.1，加水至 1000 mL。 5.13 12.5 mol/L 氢氧化钠溶液的配制：称取 50 g 氢氧化钠，溶于水，加水稀释至 100 mL。 5.14 乙腈饱和的正己烷的配制：取 100 mL 的正己烷加入 10 mL 的乙腈，充分振荡混合后
6、，上层溶液 为乙腈饱和的正己烷。 5.15 磷酸二丁胺缓冲液：取二丁胺 16.8 mL，加磷酸溶液（110）70 mL，边加边搅拌，放冷后， 用磷酸调节 pH 至 2.50.1，加水至 100 mL。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪(配有紫外检测器或二级管阵列检测器、柱温箱)。 6.2 分析天平：感量 0.1 mg、0.01 mg。 6.3 离心机：低温冷冻离心机（6770G）。 6.4 超声波清洗机。 6.5 涡旋混合机。 6.6 微孔滤膜：孔径 0.45 m 纤维素滤膜。 6.7 旋转蒸发器。 7 试样的制备 取待测新鲜的禽蛋去壳，充分搅拌，匀质。于 -18以下保存。 8 分析步骤
7、 8.1 提取 称取 5 g0.05 g 试样，置于 50 mL 离心管中，用 10 mL 乙腈匀浆 5 min，高速冷冻 6770G 离 心 10 min，移取上清液于 50 mL 离心管中。离心管中的残渣再用 10 mL 乙腈重复提取，合并上清液。 在合并的上清液中加入无水硫酸钠 3.0 g， 乙腈饱和的正己烷 20 mL， 涡旋 1 min， 6770G 离心 10 min， 弃去上层正己烷。取下层溶液备用。 8.2 净化 将 HLB 固相萃取柱分别用 5 mL 甲醇和乙腈依次润洗，加入提取液 5 mL，过柱，弃去淋洗液，用 5 mL 乙腈进行洗脱，收集洗脱液于茄形瓶中，于 40 旋转蒸
8、发至近干，浓缩液加入 1.00 mL 磷酸溶 液溶解，过 0.45 m 滤膜后，转移至 2 mL 进样瓶中，待测定。 8.3 测定 8.3.1 高效液相色谱条件 色谱柱：ODSC 18 (4.6 mm250 mm，5 m)。 流动相：水磷酸二丁胺缓冲液（975：25）为流动相A ，乙腈为流动相B，按表1 程序进行梯度洗 脱。 流 速 柱 温 检 测 进 样 8.3.2 面积均 应 8.4 空 在 8.5 结 试 料 式 中 X C m V f 注： 9 检测 9.1 灵 本 方 9.2 准 本 方 9.3 精 速 ：1.0 mL / 温 ：30 。 测 波长：280 样 量：10 L 时间 （
9、min） 0 30 32 40 取试样溶液 应 在仪器检 测 白实验 不含替米考 星 果的计算与 表 料 中替米考 星 中 ： 供试试 样 经标准 曲 试样质 量 定容体 积 稀释倍 数 结果表示 方法的灵敏 度 敏度 方 法检出限 为 确度 方 法在 20 g 密度 min。 nm。 。 、标准溶液 上 测 的线性范 围 星 的试样， 采 表 述 星 残留量（ g 样 中替米考 星 曲 线求得的 试 量 ，单位为 克 积 ，单位为 毫 数 平行测定结 果 度 、准确度 和 为 2 g/kg， /kg100 表 上 机测定， 按 围 内（见附 录 采 用完全相 同 /kg）按公 式 星 含量，
10、单 位 试 样溶液中 替 克 （g）； 毫 升（ mL） 果 用算术平均 值 和 精密度 定量限为 2 g/kg 添加 浓 表 1 梯度洗 脱 流动相A （） 82 60 82 82 按 外标法以 峰 录 A）。 同 的测定步 骤 式 (1)计算： 位 为微克/每 千 替 米考星浓度 值 表示，计算 结 0 g/kg。 浓 度水平上 的 脱 程序 峰 面积定量， 骤 进行测定 （ 千 克（g /kg ，单位为微 克 结 果保留 3 位 有 的 回收率为 7 标准溶液 及 （ 见附录A） 。 ）； 克 /每毫升 （ 有 效数字。 0110 DB34/T 流动相B （） 18 40 18 18 及 试样溶液 中 。 （ g /mL）； 。 39912021 3 中 替米考星 峰 (1) 峰 DB34/T 39912021 4 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV 15。 空 白 白 样品添加 替 图 空白 样 替 米考星对 照 图 A.1 空白 样 品添加替米 考 照 品溶液和 空 样 品中添加 图 A 附录 A （资料性 ） 考 星对照品 溶 空 白样品色 谱 1.0ng /mL 替 .2 空白样 品 ） 溶 液和空白 样 谱 图见图A.1、 替 米考星色 谱 品 色谱图 样 品色谱图 图A.2。 谱 图（峰 1、 峰 DB34/T 峰 2） 39912021 5
