1、湖南省地方标准DB43饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定高效液相色谱法Determination of Estradiol and Ethinylestradiol and Diethylstilbestrol in feedsHigh performance liquid chromatographic methodDB43/T 12032016 湖南省质量技术监督局 发 布2017-02-13实施2016-12-13 发布ICS 65.120B 46DB43/T 12032016 I 目 次 前言1 范围 12 规范性引用文件 13 原理 14 试剂与材料 15 仪器与设备 26 采样与
2、试样的制备 27 测定步骤 28 结果计算 39 灵敏度、准确度和精密度 3附录 A（资料性附录） 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图 4DB43/T 12032016 II 前 言 本标准按GB/T 1.12009给出的规则起草。 请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。 本标准起草单位：湖南省兽药饲料监察所。 本标准主要起草人：隆雪明、欧阳龙、陈福华、杨彦宁、周灿、易建希、李裕、陈启友、谭美英、黄勇、肖安东。 DB43/T 12032016 1 饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准
3、规定了饲料中雌二醇（Estradiol）、炔雌醇（Ethinylestradiol）、己烯雌酚（Diethylstilbestrol）的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于我省配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 采用甲醇提取试样中的雌二醇、炔雌
4、醇、己烯雌酚，固相萃取柱净化，收集流出液，高效液相色谱法测定，外标法定量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682一级水的规定。 4.1 甲醇，色谱纯。 4.2 乙腈，色谱纯。 4.3 甲醇。 4.4 雌二醇标准品，纯度96.0%。 4.5 炔雌醇标准品，纯度99.0%。 4.6 己烯雌酚标准品，纯度99.0%。 4.7 标准储备液：分别准确称取雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准品25mg（精确到0.01mg）于25mL容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，即为1.00mg/mL标准储备液。-18以下避光保存，有效期1年。 4.8 标准工作液：移取适量标
5、准储备液，用色谱纯甲醇稀释成浓度为(0.5 50)g/mL的标准工作液，现配现用。 4.9 中性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL，或相当者。 4.10 微孔滤膜：0.22m，有机膜。 DB43/T 12032016 25 仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。 5.2 分析天平：感量 0.00001g和 0.001g。 5.3 离心机：转速10 000r/min，带有50mL 离心管。 5.4 超声波清洗机。 6 采样与试样的制备 6.1 采样按GB/T 14699.1的规定执行。 6.2 试样制备按GB/T 20195的规定执行。 7 测定步骤 7.1 提取 称
6、取试样2g（精确到0.001g）, 置于50mL离心管中, 准确加入20mL甲醇，涡旋振摇1min, 室温下超声提取5min，涡旋30秒后静置分层，于50mL离心管中10 000r/min离心5min，取上清液供固相萃取柱净化。 7.2 净化 将固相萃取柱用3mL甲醇活化，移取适量上清液过柱，弃除前4mL流出液，收集1mL流出液，涡旋混匀，微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱分析。 7.3 测定 7.3.1 高效液相色谱参数 色谱柱：C18柱（250mm4.6mm，5m），或相当者。 流动相：乙腈+水（V+V=50+50）。 流速：1.0mL/min。 进样量：20L。 检测波长：205nm。 7.
7、3.2 试样测定 取试样溶液和相应的标准工作液进样，以组分的保留时间定性，以色谱峰面积积分值做单点或多点校准，外标法定量。标准工作液和试样溶液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的响应值均应在仪器检测的线性范围内。雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图参见附录A，雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准工作液色谱图参见附录A中图A1，饲料中添加雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准物质色谱图参见附录A中图A2。 7.3.3 空白试验 除不加试料外，采用上述相同步骤操作。 DB43/T 12032016 3 8 结果计算 试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得： SSCAVXAm= X试样中雌二
8、醇、炔雌醇、己烯雌酚的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的峰面积； Cs标准工作液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； As标准工作液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的峰面积； V提取用溶液的总体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g）； 计算结果需扣除空白试样值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示。测定结果保留三位有效数字。 9 灵敏度、准确度和精密度 9.1 灵敏度 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚在饲料中的定量限为5mg/kg。 9.2 准确度 本方法雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚在5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg
9、添加浓度水平上的回收率范围为（70120）%。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数10%，批间变异系数15%。 DB43/T 12032016 4附录A (资料性附录） 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min0102030405060mV检测器 A Ch1:205nm 图A1 雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准工作液色谱图（5g/mL） 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min01020304050607080mV检测器 A Ch1:205nm 图A2 饲料中添加雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准物质的色谱图（50mg/kg）
