1、 ICS 67.120.20 CCS X 18 34 安徽省地方标准 DB34/T 1376 2022 代替 DB34/T 1376-2011 鸡蛋中氟 苯尼考残 留量的测 定 Determination of florfenicol residues in eggs 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布 DB34/T 1376 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 代替DB34/T 1376-2011 鸡蛋 中氟 苯尼
2、考 的 残留 测定-高 效液 相色 谱法，除编 辑性 修改 外主要技 术变 化如 下：a)增加高 效液 相色 谱-串联 质 谱法（见第 5 章）；b)更改范 围为：本文 件规 定 了鸡蛋 中氟 苯尼 考残 留量 的测定 方法。本标 准适 用 于鸡蛋 中氟 苯尼 考残留量 的测 定；c)删除2 规范 性引 用文 件 中GB/T 14699.1。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本 文件 由安 徽省 兽药 饲料 监察所 提出。本文件 由安 徽省 农业 农村 厅归口。本文件 起草 单位：安徽 省 兽药饲 料监 察所、安徽 赛 如分析
3、 检测 科技 有限 公司、宁 国市 民鸿 农业 科技有限公 司、桐城 市畜 牧兽 医管理 中心、泗 县草 沟镇 畜牧兽 医水 产站、宣 城市 宣州区 市场 监督 管理 局、合肥市动 物疫 病预 防控 制中 心、望 江县 农产 品质 量安 全中心、淮 北市 畜牧 中心、安徽 农业 大学、安 徽 省 农业科学 院畜 牧兽 医研 究所。本文件 起草人：李 珲、董 尚青、朱明齐、韩 素珍、操军、王雨霜、吴 昊、许 世富、程莹、侯亚 飞、郝金华、左 爱民、钱 志松、刘发 全、祁钊、潘 孝成、宋亚 伟。2011年 首次 发布 为DB34/T 1376-2011，2022 年 第 一次修 订。DB34/T
4、1376 2022 1 鸡蛋中氟 苯尼考 残留量的 测定 1 范围 本文件 规定 了鸡 蛋中 氟苯 尼考残 留量 的测 定方 法。本文件 适用 于鸡 蛋中 氟苯 尼考残 留量 的测 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 高效液 相
5、色 谱法 原理 试样中 残留 的氟 苯尼 考经 乙酸乙 酯提 取，正己 烷脱 脂，高 效液 相色 谱仪 测定，外标 法定 量。试剂和 材料 除非另有说明，本法所 用 试剂均 为分 析纯，水 为符 合 GB/T 6682 规定 的二 级 水。4.2.1 氟苯尼 考标 准品：纯 度 98。4.2.2 甲醇：色谱 纯。4.2.3 乙酸乙 酯。4.2.4 正己烷。4.2.5 氢氧化铵：25 28。4.2.6 无水硫酸钠：经 300 灼烧4 小时，置 于 干 燥 器 中 备 用。4.2.7 流动相：甲 醇：水（40：60）。4.2.8 聚 丙 烯 离 心 管：50 mL，1.5 mL。4.2.9 比色管
6、：50 mL，具 塞。4.2.10 梨 形瓶：25 mL。4.2.11 滤膜：0.45 m，无机 相。4.2.12 氟 苯 尼 考 标 准 储 备 液（1 mg/mL）：准 确 称 取 氟 苯 尼 考 标 准 品100 mg，用 甲 醇 稀 释 至100 mL，摇匀，-18 保 存，有 效 期 90 天。4.2.13 氟 苯 尼 考 工 作 液（10 g/mL）：准 确 移 取（4.2.12）中 氟 苯 尼 考 标 准 储 备 液 1.0 mL，用甲醇稀释配制成 100 mL，摇 匀，-4 保 存，有 效 期 30 天。DB34/T 1376 2022 2 4.2.14 氟苯 尼考标 准溶 液
7、：取 氟 苯尼考 工作 液（4.2.13）适量，分别 用流 动相（4.2.7）稀 释为0、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL 的标准溶液，摇匀，4 保存，有 效期 7 天。仪器 和设 备 4.3.1 高效液相 色 谱仪，配 二极 管阵列 检测 器或 紫外 检测 器。4.3.2 离心机，转 速不 低于 4000 r/min。4.3.3 振荡器。4.3.4 涡旋混合器。4.3.5 分析天平：感量 0.0001 g，0.01 g。4.3.6 超声波清洗器。4.3.7 组织匀浆机。4.3.8 旋转蒸发仪。测定步 骤 4.4.1 试样提 取 称
8、取均 质 后的试样 5 g（精确至0.01 g），置于 50 mL 聚丙烯离心管中，依次加入 30 mL 乙酸乙酯（4.2.3），0.9 mL 氢氧 化铵（4.2.5），5 g 无水 硫酸 钠，振荡 提取 30 s，以 4000 r/min 离心 5 min，上 清 液 转 移 至 50 mL 比 色 管 中，用 乙 酸 乙 酯 定 容 至 刻 度，摇 匀 后 取 10 mL 乙 酸 乙 酯 提 取 液 到 25 mL 梨 形 瓶 中，45 水 浴 中 旋 转 浓 缩 至 干。4.4.2 试样净 化 梨形瓶中 的残 渣用 3 mL 水溶解，超 声 5 min，加 入 3 mL 正 己烷（4.2
9、.4）涡旋混 合 30 s，静置分层，弃掉 上 层 的 正 己 烷，再 加 3 mL 正 己 烷（4.2.4）涡 旋 混 合 30 s，静 置 分 层，移 取 1 mL 水相于 1.5 mL 的 聚 丙 烯 离 心 管 中，以 8000 r/min 离心 5 min，经 0.45 m 滤 膜 过 滤，供 高 效 液 相 色 谱仪分析。4.4.3 色谱测 定 色谱柱：C18（4.6250 mm，5 m），或相 当者。柱温：40。进样体积：20 L。流速：1.0 mL/min。检测波长：365 nm。流动相：甲醇-水（40：60）。4.4.4 上机测 定 取适量 试样 溶液 和相 应浓 度的标 准
10、溶 液，作单 点或 多点校 准，以色 谱峰 面积 积分值 定量。标 准溶 液及 试 样 液 中 氟 苯 尼 考 的 相 应 值 均 在 仪 器 检 测 的 线 性 范 围 内，标 准 溶 液 高 效 液 相 色 谱 图 见 附 录A中 图A.2。结果计 算 按 照 下式计算 试样 中各 种 药物的 含量：DB34/T 1376 2022 3 X=A CS V 1000AS m 1000(1)式中：X 试样 中各 种药 物的 含量，单位 为毫 克每 千克（mg/kg）；A 试样溶液 对 应 的 色 谱 峰 面 积 响 应 值；As 标准溶液对 应 的 色 谱 峰 面 积 响 应 值；V 定 容
11、体 积，单 位 为 毫 升（mL）；Cs 标 准 溶 液 的 浓 度，单 位 为 微 克 每 毫 升（g/mL）；m 试 样 质 量，单 位 为 克（g）。平行测定结果用算术平 均 值表示，结 果保 留三 位有 效数字。检测方 法灵 敏度、准 确度、精密 度 4.6.1 灵敏度 本 方法 在鸡 蛋中 的检 出限 为 20 g/kg。4.6.2 准确度 本方法 在添 加浓 度为 80 g/kg 添加 水平 的回 收率 均 为 70 110。4.6.3 精密度 本方法 的批 内变 异系 数 小 于等于 10，批间 变异 系 数 小于 等于 15。5 高效液 相色 谱-串联 质谱 法 原理 试样经过
12、80 乙 腈水 溶液 提取，HLB 固 相萃 取柱 净化，高效液 相色 谱串 联质 谱法 测定，外 标法 定量。试剂和 材料 除特殊 说明 外，本方 法所 用试剂 均为 分析 纯，用水 符合 GB/T 6682 中 一级 水 的规定。5.2.1 乙腈：色谱 纯。5.2.2 甲醇：色谱 纯。5.2.3 乙酸铵。5.2.4 5 mmol/L 乙酸 铵水 溶液：准确称 取 0.385 g 乙酸 铵，用水 定容 到 1 L。5.2.5 80乙 腈水 溶液：准 确量 取 800 ml 乙腈（色 谱纯），用 水 定容 至 1 L。5.2.6 10甲 醇水 溶液：准 确量 取 100 ml 甲醇（色 谱纯）
13、，用 水 定容 至 1 L。5.2.7 氟苯尼 考 标 准品：纯 度 99.0，CAS 号：73231-34-2。5.2.8 标准溶 液制 备 如 下：a)氟苯尼 考标准 储 备液（400 g/mL）：精确 称取 20 mg 氟 苯尼 考 标 准品（精确至 0.01 mg），置于 50 mL 容 量瓶 中，用 乙腈 溶 解，此溶 液浓 度为，-18 保 存，有效 期 6 个月。b)氟苯尼 考 标 准工 作溶 液：分别吸 取 氟 苯尼 考标 准储 备液（5.2.8 a）10 L、50 L、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL 于 10 mL 容量 瓶中，用 乙腈 定容，标 准工
14、作溶 液系 列浓度 分别 为 0.4 g/mL、2 g/mL、4 g/mL、10 g/mL、20 g/mL、40 g/mL，4 保存，有 效期 一周。DB34/T 1376 2022 4 仪器和 设备 5.3.1 高效液 相色 谱串 联质 谱仪：配电 喷雾 离子 源（ESI）。5.3.2 分析 天 平：感量 0.1g、0.1 mg、0.01 mg。5.3.3 离心机：10000 r/min。5.3.4 微孔滤 膜：0.22 m 有机 滤膜。5.3.5 涡动仪。5.3.6 水平摇 床。5.3.7 氮吹仪。5.3.8 固相萃 取柱：HLB（60 mg/3 mL）或相 当者。分析步 骤 5.4.1
15、提取 称取 2.00 g（0.1 g）试 样，置 于 50 mL 离心 管内，加入 8.0 mL 80 乙腈 水溶液（5.2.5），涡旋 1 min 混匀，振 荡 10 min，10000 r/min 离心 10 min，取 上清 液备 用。5.4.2 净化 准确量 取 4.0 mL 上清 液（5.4.1），置 于HLB 固相 萃取柱 中，保持 每秒 一滴，收集 全部 的流 出液。45 水浴 氮气 吹干，用1.0 mL 10 甲醇 水溶 液（5.2.2）溶解，涡旋 混匀，0.22 m 滤膜 过滤，供 高效液相 色谱-串 联质 谱仪 测 定。5.4.3 液相色 谱参 考条 件 色谱柱：C18（2
16、.1 mm50 mm，1.8 m）或 相当 者；流动相：A：5 mmol/L 乙 酸铵水 溶液，B：乙 腈；采 用梯度 洗脱 见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 L；柱温：35。表1 液相色 谱梯 度洗 脱方 式 时间（min）A（）B（）0-2 95 5 2.01 95 5 8 5 95 8.01 95 5 10 95 5 氟苯尼 考 标 准工 作溶 液和 试液分 别注 入液 相色 谱仪，记录 色谱 图，按外 标法 以峰面 积定量。5.4.4 质谱参 考条 件 检测方 法：多离 子反 应监 测（MRM），详 见表2中 母离子、子 离子 和碰 撞能 量。质谱离 子源 参考 条件：氮
17、气温 度（Gas Temp）：260；氮气流 速（Gas Flow）：40 L/min;DB34/T 1376 2022 5 雾化器 压力（Nebulizer）：40 psi;鞘气温 度（Shealth Gas Temp）：300;鞘气流 速（Shealth Gas Flow）：17 L/min；毛细管 电压（Capillary）：3000 V;喷嘴电 压（Nozzle Voltage）：1700 V.表2 定性、定量 离子 对及 其他 参数条 件 药物名称 定性、定量离子对 扫描模式 裂解电压（E/V）碰撞能量（E/V）氟苯尼考 356.1/119*ESI-380 23 356.1/184.
18、9 12 注：其中356.1/119*为定 量离 子对。5.4.5 定性 试样中 氟苯 尼考 色谱 峰的 保留时 间与 标准 色谱 峰的 保留时 间相 比较，变 化范 围 应在 2.5 之内。氟苯尼 考的 定性 离子 色谱 峰的信 噪比 应大 于等 于 3（S/N 3），氟 苯尼 考的 定 量离子 色谱 峰的 信噪 比 应大于等 于 10（S/N 10）。每种化 合物 的质 谱定 性离 子必须 出现，至 少应 包括 一 个母离 子和 两个 子离 子，而且同 一检 测批 次，对同 一化合 物，样品 中目 标化 合物的 两个 子离 子的 相对 丰度比 与浓 度相 当的 标 准 溶液相比，其 允许
19、偏差 不超 过表3 规定 的范 围。色谱 图 参见附 录A 的图A.4。表3 定性时 相对 离子 丰度 的最 大允许 偏差 相对离子丰度 50 20 至50 10 至20 10 允许相对偏差 20 25 30 50 各检测 目标化 合物 以保留 时间和 两对离 子（特征离 子对/定 量离 子对）所对 应 的液相 色谱串 联质 谱法 色 谱峰 面 积相 对 丰度 进行 定 性，要 求被 测 试样 中目 标 化合 物 的保 留 时间 与标 准 溶液 中 目标 化 合物的保留时 间一 致（一致 的条 件是偏 差小 于 20），同 时要求 被测 试样 中目 标化 合物的 两对 离子 对应 液 相色谱串
20、 联质 谱法 色谱 峰面 积比与 标准 溶液 中目 标化 合物的 面积 比一 致。5.4.6 试样测 定 按照5.4.3 和5.4.4 确立 的 条件，测定试 液（5.4.2）和标准 系列溶 液（5.2.8 b）中 氟苯尼 考的离子强 度，外标 法定 量，色谱图 参见 附录A的图A.5。色谱参 考保 留时 间：氟苯 尼考 4.34 min。5.4.7 空白试 验 不称取 试样，按5.4.5 的 步 骤做空 白实 验。应确 认不 含有干 扰被 测组 分的 物质。5.4.8 标准曲 线绘 制 将标准 系列溶 液（5.2.8 b）由 低到 高浓 度 进样 检 测，以 峰面积-浓度 作图，得到标 准曲
21、线 回归方程。5.4.9 定量测 定 DB34/T 1376 2022 6 待测样 液中 被测 组分 的 响 应值应 在标 准曲 线线 性范 围内，超过 线性 范围 时，则 应将液 样用 空白 基 质溶液稀 释后 重新 进样 分析 或减少 取样 量，重新 按照5.4.1进 行处 理后 再进 样分 析。6 分析结 果的 表述 外标法 定量，按 式（2）计 算氟苯 尼考 的残 留量。=1000 1000(2)式中：X 试 样中 氟苯 尼考 含 量，单 位为 毫克/每 千克（mg/kg）；C 试 液色 谱峰 对应 的 氟苯尼 考 浓 度，单位 为微 克/每 毫升（g/mL）；m 试 样质 量，单位
22、为 克（g）；V 定 容体 积，单位 为 毫升（mL）f 稀 释倍 数。以重复 性条 件下 获得 的两 次独立 测定 结果 的算 术平 均值表 示，结果 保留 三位 有效数 字。检测方 法的 灵敏 度、准确 度和精 密度 6.1.1 灵敏度 本方法 检出 限为 0.2 g/kg，定 量限 为 0.5 g/kg。6.1.2 准确度 本方法 在添 加浓 度水 平上 的 回收 率为 70 110。6.1.3 精密度 本方法 的批 内变 异系 数 小 于等于 10，批间 变异 系 数 小于 等于 15。DB34/T 1376 2022 7 附录A（资料 性）色谱图 A.1 空白鸡 蛋样 品溶 液色 谱图 图A.1 空白鸡 蛋样 品溶 液色 谱图 A.2 标准物 质溶 液色 谱图 图A.2 标准物 质溶 液色 谱图 A.3 空白鸡 蛋中 添加 标准 物质 溶液色 谱图 图A.3 空白鸡 蛋中 添加 标准 物质 溶液色 谱图 DB34/T 1376 2022 8 A.4 氟苯尼 考定 性离 子对 色谱 图 图A.4 氟苯尼 考定 性离 子对 色谱 图 A.5 氟苯尼 考定 量离 子对 色谱 图 图A.5 氟苯尼 考定 量离 子对 色谱 图
