1、湖南省地方标准DB43湖南省市场监督管理局 发 布DB43/T157 2020 92020-12-29发布 2021-03-29实施ICS 65.020CCS B 16稻曲病菌分子检测技术规程Technical Regulations for Molecular Detection of Ustilaginoidea virensDB43/T 19572020 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 4 原理 1 5 仪 器设 备与 试剂 1 5.1 仪器 设备 1 5.2 主要 试剂 1 6 采样 2 6.1 样品 采集 2 6.2 样品 贮运
2、与存 放 2 7 操 作方 法 2 7.1 样品DNA 制备 2 7.2 检测 2 8 结 果判 定 3 9 样 品保 存与 处理 3 附录A（资 料性）稻曲 病相关 资料 4 附录B（规 范性）水稻 稻曲病 菌鉴 定报 告 5 DB43/T 19572020 II DB43/T 19572020 III 前 言 本文件 按 照GB/T 1.1 2020 给 出的 规则 起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单
3、位：湖 南省 植物保 护研 究所、株 洲市 农业科 学研 究所。本文件 主要 起草 人：陈岳、谭新 球、李成 刚、吴龙 云、王 淋玉、张 卓、张鑫、史晓 斌、李小 娟、肖友伦、张德 咏、刘勇。DB43/T 19572020 IV DB43/T 19572020 1 稻曲病菌 分子检 测技术规 程 1 范围 本文件 规定 了稻 曲病 菌 PCR 检测 的样 品制 备、检测 技术和 操作 程序。本文件 适用 于土 壤、水稻 种子和 稻谷 中 稻 曲病 菌的 分子检 测。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日
4、期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术 语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。稻曲病 菌无 性态 为 Ustilaginoidea virens，属半 知菌 亚 门、腔孢 纲、瘤 座孢 目、绿核菌 属，病 原有 性阶段有 性态 为 Claviceps oryzae sativae，属 子囊 菌门、子囊 菌纲、麦 角菌 属、稻麦角 菌。稻曲 病主 要危害水稻 穗部 并形 成稻 曲球，严重 影响 水稻 的产
5、量和 稻米品 质。见附 录A。PCR（Polymerase Chain Reaction），聚 合酶 链式 反应，是指 在 DNA 聚 合酶 催化 下，以 母 链 DNA 为模板，以 特定引 物为 延伸起 点，通 过变性、退 火、延 伸等步 骤，体 外复 制出与 母链模 板 DNA 互 补的子 链DNA 的 过程。是 一项DNA 体外合 成放 大技 术，能快 速特异 地在 体外 扩增 任何 目的 DNA。4 原理 核糖体 基因 转录 间隔 区（Internal transcribed spacer ITS）进 化速 率较 编码 区快，在真菌 种间 存在 着丰富的 变异，而在 种内 不 同菌株
6、间却 高度 保守，可 以为病 原菌 的分 子检 测提 供理想 的靶 序列。根据 稻 曲病菌ITS 的 特异 序列，合 成 1 对 特异 性引 物，获得 稻曲病 菌特 异性 扩增 片段，用于 土壤、水 稻种 子 和 稻谷中稻 曲病 菌的 快速 分子 检测。5 仪 器设 备与 试剂 5.1 仪器 设备 PCR 检 测仪、凝 胶成 像仪、土壤 取样 器、台式 离心 机、纯 水仪、电 泳仪、旋 涡振荡 器等。5.2 主要 试剂 DB43/T 19572020 2 苯酚/氯仿/异戊 醇、乙 醇、二甲 基亚砜、氢 氧化钠、脱脂 奶粉、DNA marker、吐温 20、PCR 试剂 盒等。除特别 说明 以外
7、本 文件 所用试 剂均 为分 析纯，实 验用水 应符 合 GB/T 6682 的规定。6 采样 6.1 样品 采集 6.1.1 土壤 水稻 田W 型5 点 取样，取1-10 cm 深 度的50 g 土 壤 样品。6.1.2 水 稻种 子和 稻谷 将稻种 或稻 谷混 匀后 称 取50 g。6.2 样品 贮运 及存 放 样品采 集后，放入 密闭 的 容器内，送 实验室。将 取 样结果 进行 记录，记录 表 格见附 录 B。处理 的样品应保 存在-20 以 下，避 免反复 冻融。7 操 作方 法 7.1 样品DNA 制备 7.1.1 土 壤中DNA 的提 取 土壤风 干后，制 成100 目 的土壤
8、 样品，取 10 g 土 壤 加入 5 mL 无菌 水，冷冻 抽 干 24-48 h，加 入少量石英 砂，倒入 液氮 充分 研磨，将研 磨后 的土 壤分 装至 1.5 mL 离 心管 中，每管加 入 500 l 0.4 脱脂奶粉 溶液，涡 旋混 匀。12000 rpm/min 离心 10 min。取上 清加 入等 体积 浓度 为 20 g/mL 的 蛋白 酶K缓冲液，55 水 浴 2h。水 浴结束 后，加入 1/2 体积 的 7.5 M NH4Ac 溶液，混 匀。12000 rpm/min 离心10 min。吸上清液加入2 倍体积无水乙醇，-20 沉 淀0.5 h，12000 rpm/min
9、离心10 min，去 除 上 清 液，70 乙醇洗 涤沉 淀物，室 温晾干。提 取 的DNA 用 20l 含 RNA 酶的 TE 缓冲 液 溶解，-20 保 存备用。土壤DNA 也 可用 土 壤DNA 提取试 剂盒 提取。7.1.2 种 子和 稻谷 中DNA 的提取 将混匀 后的 稻种 液氮 研磨 成粉末，称 取0.1 g 于2 mL 管子 中，加入800 l CTAB 提 取液，65 水浴 15 min，期 间反 复摇 匀；加 入等 体积 苯酚/氯仿/异戊醇，混匀 后摇 床轻 摇20 min；12000 rpm/min 离心 10 min，移上 清500 l，加入2 倍 体积 的无 水乙 醇
10、20 沉淀0.5 h，12000 rpm/min 离心 10 min，去除上 清液，70 乙醇 洗 涤沉淀 物，室 温晾 干。提 取 的DNA 用 20 l 含 RNA 酶的 TE 缓冲 液溶 解，-20 保存备 用。7.2 检测 7.2.1 PCR 检测 DB43/T 19572020 3 7.2.1.1 反应 体系 针 对 水 稻 稻 曲 病 菌 与 其 他 属 种 病 菌 ITS 序 列 差 异 设 计 了 一 对 特 异 性 引 物。UV-F：5-CTTGTGTTTTCCAATGCATGT-3；UV-R：5-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3。引物 由生物 公司 合成。
11、稻 曲病菌 PCR 检测 反应 条件 为：反应体 积 为 25 L，其中 包括 10 PCR buffer 2.5 l，10 mol/L 的引 物对各0.2 l，MgCl2(5mM)2.5 l，dNTPs（10mM）2.0 l，Taq Polymerase 1U，DMSO 0.5 l，DNA模板溶 液 各1 l，10 梯 度稀释 的稻 曲病 菌基 因 组DNA 作 为阳 性模 板，阴性 对 照采用 无菌 水，另设 一个不加 任何 模板 的空 白对 照。7.2.1.2 反应 条件 PCR 扩增 程序：94 预 变 性 3 min；94 变 性 30 sec，60 退 火 30 sec，72 延
12、伸 30 sec，32 个循环；72延伸 7 min。7.2.1.3 琼脂 糖凝 胶电 泳 将 5-10 lPCR 产物用 1 琼脂 糖电 泳分 离（电压 为 120V，时 间为 20min），经溴化 乙锭 染色 后于紫外灯 下根 据扩 增产 物的 大小判 定结 果。8 结 果判 定 在阳性 对照、阴 性对 照和 空白对 照结 果均 正常 的情 况下：如待 测样 品扩 增出 346 bp 左 右的条 带，则判定 为该 样品 水稻 稻曲 病菌 PCR 鉴 定结 果为 阳性；如待 测样 品未 扩增 出 346 bp 左右 的条 带，则判 定为该样 品水 稻稻 曲病 菌PCR 鉴定 结果 为阴 性。
13、9 样 品保 存与 处理 样品经 登记 和经 手人 签字 后妥善 保存。对 稻曲 病菌 PCR 检 测结 果为 阳性 的样 品应保 存于-20 冰 箱中，以 备复 核。该样 品保 存期满 后须 经高 压灭 菌（121 15min）后 处理。DB43/T 19572020 4 附 录 A（资料 性）稻曲病 相关 资料 A.1 分布 地区 稻曲病 的发 生分 布较 为广 泛，在 中国、日本、美国、缅甸、印度、菲律 宾等 近 40 个国 家均 有发 生。国内江 南、华南、西 南及 东北稻 区已 有该 病的 发生 报道。湖南 稻区 中、晚稻 稻曲病 发生 普遍，尤 以 中 稻发生严 重。A.2 病状
14、稻曲病 主要 危害 水稻 穗部 并形成 稻曲 球（见 图 A.1）。病 菌侵 染初 期，小 穗基 部逐渐 隆起 且呈 现白色；随 后病 菌突 破颖 壳，膨大，外层 被膜 包裹；病 粒逐渐 膨大 呈圆 球状，淡 黄色，外部 开裂；稻曲 球 继续生长 膨大，被 膜完 全破 裂，露 出病 原菌 的后 垣孢 子，形 成黄 色稻 曲球。稻 曲球最 初为 橘黄 色，后 逐 渐加深，变为 黄绿 色、暗绿 色、墨 绿色 至黑 色，最后 病粒外 层覆 盖一 层戎 状厚 垣孢子 粉。根据 稻曲 球 总 病菌发育 程度 的不 同，从内 到外可 以分 为3 层：最里 层浅黄 色，由密 集的 菌丝 体和大 量的 厚垣
15、孢子 组成；中间层 是橘 黄色，由 菌丝 和厚垣 孢子 构成；最 外层 墨绿色，由 成熟 的黑 色厚 垣孢子 和 老 熟的 菌丝 组 成。图A.1 水 稻稻 曲病 菌危 害状 A.3 侵染 与病 害流 行 稻曲病 的发 生流 行与 多种 因素有 关，主要 包括 品种、田间 菌源 量、气候 条件 及栽培 管理 措施 等，其中气候 条件 尤其 是水 稻孕 穗至破 口期 的湿 度条 件是 影响稻 曲病 菌侵 染的 重要 因素之 一，在水 稻孕 穗期 至破口期，雨 量多、日 照少 利于稻 曲病 的发 生。不同 品种对 稻曲 病菌 的抗 性也 存在差 异，一般 晚熟 品 种 比早熟品 种发 病重，糯稻 比 粳稻感 病，杂 交稻 比常 规 稻感病。田间 稻曲 病菌 的 菌源量 与稻 曲病 的发 生有 显著相关 性，老病 区、重病 区比 新 稻区 发病 重。DB43/T 19572020 5 附 录 B（规范 性）水稻稻 曲病 菌鉴 定报 告 样品种 类 采样时 间 采 样地 点 样品数 量 采样部 位 样品来 源 送检日 期 送检人 送检单 位 联系电 话 检测鉴 定方 法：检测鉴 定结 果：备注：鉴定人（签 名）：审核人（签 名）：鉴 定单位 盖章：年 月 日 注：本单一式两份，检测单位和受检单位各一份。本检测结果只对送检样品负责。
