1、Regulations for quality inspection of morchella strains羊肚菌菌种质量检验规程发 布 湖南省市场监督管理局 2022-05 发 布-0643湖南省地方标准ICSCCS 67.080B 31DB43/T2327 2022 2022-08 实 施-06DB43/T 23272022 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 4 抽样 1 5 感 官检 验 1 6 杂 菌及 害虫 检验 1 7 菌 种鉴 定 2 8 菌 种活 力检 验 2 9 栽 培检 验 3 10 判 定规 则 3 11 档 案管 理
2、 4 附录A（资 料性）羊肚 菌基因 组 DNA 提 取方 法 5 附录B（资 料性）PCR 扩 增体系 和扩 增程 序 6 附录C（资 料性）羊肚 菌菌种 质量 检验 档案 7 DB43/T 23272022 II DB43/T 23272022 III 前 言 本文件 按 照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构和起 草规 则 的规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南农 业标 准化 技术委 员会 归口。本文件 起草
3、 单位：湖南 省 微生物 研究 院、湖 南湘 蕈 生物科 技有 限公 司、湖 南 双红农 科生 态工 程有 限公司。本文件 主要 起草 人：许 隽、喻 桃生、雷潇、邵 晨霞、唐少军、贺月 林、靳 磊、吴胜莲、杨祎、任锐、孙志光、何 晓林。DB43/T 23272022 IV DB43/T 23272022 1 羊肚菌菌 种质量 检验规程 1 范围 本文件 规定 了羊 肚菌 菌种 质量检 验的 术语 和定 义、抽样、感观 检验、杂 菌及 害虫检 验、菌种 鉴定、菌种活 力检 验、栽培 检验、判定 规则、档 案管 理等 技术要 求。本文件 适用 于羊 肚菌 母种、原种 和栽 培种（以 下简 称“菌
4、 种”）的 质量 检验。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 12728 食 用菌 术语 GB/T 30989 高 通量 基因 测序技 术规 程 NY/T 1284 食 用菌 菌种 中 杂菌及 害虫 的检 验 NY/T 1846 食 用菌 菌种 检 验规程 DB43/T 1908 羊肚 菌简 易 拱棚栽 培技 术规 程 3 术 语和 定义 GB/T
5、 12728 界 定的 以及 下 列术语 和定 义适 用于 本文 件。3.1 羊肚菌 morchella spp.隶属子 囊菌 门（Ascomycota）、盘菌 纲（Discomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚 菌 科（Morchellaceae）、羊肚菌 属（Morchella），因 其外表 凹陷 状似 羊肚 而得 名。4 抽样 菌种的 抽样 应符 合NY/T 1846 的 规定。5 感 官检 验 样品的 感官 检验 应符 合NY/T 1846 的 规定。6 杂 菌及 害虫 检验 样品的 杂菌 及害 虫检 验应 符合 NY/T 1284 的规 定。DB43/T 232720
6、22 2 7 菌 种鉴 定 7.1 菌丝 体培 养 将活化 的羊肚 菌菌 块接种 于液体 土豆培 养基，20 静置培 养 7 d 10 d，然 后收集 菌丝体，用 无菌水反 复清 洗干 净，再用 灭菌滤 纸吸 干水 分，直接 使用或-20 保 存。7.2 基因 组DNA 提取 基因 组DNA 的提 取方 法参 见附 录 A，得到 的DNA 浓 度不宜 低 于 50 ng/l，1.7A260/A2802.0。7.3 PCR 扩增 选择 ITS 通 用引 物 ITS1/ITS4：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR 扩增 体系 和扩增程序 参见
7、附 录 B。7.4 电泳 检测 采用琼 脂糖 凝胶 电泳 检 测PCR 产 物，用 凝胶 成像系 统 拍照并 记录 电泳 条带，黑 色羊肚 菌类 群（包 括梯棱羊 肚菌、六妹 羊肚菌、七妹 羊肚菌 等）条带应 为 800 bp，条带大 小正 确 且无其 他杂带 的样 品应进行双向 测序，测 序方 法应 符合 GB/T 30989 的 规定。7.5 数据 库比 对 获得的 测序 结果 应 在NCBI 数据库 进 行Blastn 比对（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/），或者 在RDP 数 据库 进行Classifier 比对（http:/rdp.cme.msu.edu
8、/classifier/classifier.jsp），初 步分 析测序菌 种的 分类 地位。7.6 系统 发育 树的 构建 下载准 确的 的羊 肚 菌 ITS 序列，利用 软 件 CLUSTAL 进行多 序列 比对，用 软 件 MEGA 通过 最大 简约 法(maximum parsimony,MP)和邻位相 连法(neighbour joining,NJ)分别 构建分 子系统发 育树，初步 确定测序 菌种 的分 类地 位。适宜生 产的 菌种 分类 地位 应为梯 棱羊 肚菌、六 妹羊 肚菌、七妹 羊肚 菌等。8 菌 种活 力检 验 8.1 平板 继代 培养 在含 PDA 固 体培 养基 的培
9、 养皿中 央接 种初 始菌 种的 菌块，20 避光 培 养 2 d 3 d，当 菌丝 生长 至距离培 养皿 边缘 约 1 cm 处 时，用 打孔 器取 菌丝 前端 直径 0.5 cm 的圆 形菌 块，转接至 新 的 PDA 培养 皿 中继代培 养。8.2 菌种 萌发 检验 菌块应 在继 代培 养6 h 10 h 后 萌发。8.3 菌丝 生长 速率 检验 采用十 字交 叉法 分别 在继 代培 养 1 d、2 d、3 d 时 测 量羊肚 菌菌 落直 径，计算 菌丝生 长速 率，羊肚DB43/T 23272022 3 菌菌丝 平均 生长 速率 应大 于 10 mm/d。8.4 菌丝 长势 检验 菌丝
10、应 均匀，菌 落边 缘应 整齐。8.5 菌丝 微观 形态 检验 继代培 养2 d 3 d 后，使 用体视 显微 镜观 察主 菌丝 和二级 菌丝 分枝 的夹 角，夹角应 小 于 30。8.6 菌核 检验 继代培 养 5 d 10 d 后，菌落上 应产 生白 色颗 粒，培养 14 d 后白 色颗 粒应 变 成黄棕 色菌 核；无菌核产生 的菌 种不 宜用 于生 产。8.7 菌落 颜色 检验 继代培 养10 d 15 d 后，菌落应 无色 素或 色素 较浅；色素 产生 多的 菌种 不宜 用于生 产。9 栽 培检 验 9.1 试验 场地 宜选择 温湿 度、光照、通 风等可 控的 菇房 或人 工气 候培养
11、 箱。9.2 栽培 方式 宜采用 塑料 筐覆 土或 床架 覆土方 式进 行小 量栽 培试 验，每 个菌 种栽 培面 积应 不少 于 3 m2，至 少有3个随机 小区 重复，栽 培管 理参 见 DB43/T 1908。9.3 菌种 萌发 检验 播种1 d 3 d 菌种 应萌 发。9.4 分生 孢子 检验 播种5 d 10 d 菌丝 应在 土壤中 迅速 扩延，应 产生 适量的 菌霜（分 生孢 子）。9.5 外源 营养 袋检 验 施加外 源营 养 袋20 d 30 d，营 养袋 应充 满羊 肚菌 菌丝。9.6 羊肚 菌原 基检 验 土壤表 面应 产生 大量 原基，原基 应有 分化 为幼 菇的 趋势。
12、10 判 定规 则 菌种的 感官 检验、杂 菌及 害虫检 验、菌种 鉴定、菌 种 活力检 验、栽培 检验 均符 合要求 的为 合格 菌种。DB43/T 23272022 4 11 档 案管 理 应建立 羊肚 菌菌 种检 验档 案，档 案内 容应 包括 但不 限于感 官检 验、杂菌 及害 虫检验、菌 种鉴 定、菌种活力 检验、栽 培检 验等 内容，档案 应保 存 3 年以 上。DB43/T 23272022 5 附 录 A（资料 性）羊肚菌 基因 组DNA 提 取方 法 羊肚菌 基因 组DNA 提取 按 照以下 步骤 进行：a）将 菌丝 体加 入液 氮研 磨成粉 末，取 约0.1 g 粉 末转移
13、 至无 菌 的 2 ml 离 心 管中；b）加入 700 l 裂 解液（CTAB 2，pH=8.0）65 裂 解 1.5 2.0 h，每 隔10 min 颠 倒混 匀；c）12000 r/min 离心 10 min，取上 清液 转移 至新 的 离心管；d）加 入等 体积 的PCA（苯酚:氯仿:异戊 醇=25 241），缓慢 混匀；e）12000 r/min 离心 10 min，取上 清液 加入 等体 积CA（氯 仿:异 戊醇=24 1），缓 慢混 匀；f）12000 r/min 离心10 min，取 上清 液加 入2 倍体 积的无 水乙 醇，缓慢 混匀，置20 静 置1 h以上；g）12000
14、 r/min 离心 10 min 弃 上清 留下DNA 沉淀；h）用1 mL 75 乙 醇清 洗 DNA 沉淀，离 心弃 上清；i）用含 1 RNase A 的 TE 缓冲液（Tris-HCl 10 mmol/L,EDTA 1 mmol/L）或灭菌双蒸水溶解沉淀；j）采 用超 微量 分光 光度 计或琼 脂糖 凝胶 电泳 检 测DNA 浓 度和 质量。DB43/T 23272022 6 附 录 B（资料 性）PCR 扩 增体 系和 扩增 程序 B.1 PCR 扩增 体系 PCR 扩 增的 总体 积为50 l，其 中10 PCR Buffer 5 l，dNTPs 5 l，引 物ITS1/ITS4
15、各1 l，Taq 聚 合酶0.5 l，模 板DNA 2 l，双蒸 水35.5 l。B.2 PCR 扩增 程序 首 先 94 预 变 性 5 min；然后 94 变 性 30 sec，55 退 火 30 sec，72 延伸 60 sec，30 个循环；最 后 72 延 伸7 min。DB43/T 23272022 7 附 录 C（资料 性）羊肚菌 菌种 质量 检验 档案 表1 羊肚 菌菌 种质 量检 验档案 表 菌种名称 菌种来源 菌种级别 接种日期 保藏条件 联系人 菌种质量检验步骤 感官检验 气味 瓶塞（盖）松紧度 菌种颜色 干燥度 记录人 杂菌及害虫 检验 斑点 液体培养检验 液体培养检验 镜检 记录人 菌种鉴 定 DNA 浓度 电泳结果 测序结果 进化树分析 记录人 菌种活力检验 菌种萌发 菌丝生长速率 菌丝长势 菌丝微观形态 菌落颜色 菌核 记录人 栽培检验 菌种萌发 分生孢子 原基数量/m2 记录人 判定结果 是否合格 记录人
