1、 ICS 67.050 CCS X 04 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27852022 食用向日葵品种纯度鉴定 SNP 标记法 Varietal verification of the confection sunflower(Helianthus annuus L.)SNP marker technology 2022-08-30 发布2022-09-30 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 27852022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SA
2、M/TC 20）归口。本文件起草单位：三瑞农业科技股份有限公司、华智生物技术有限公司、巴彦淖尔市产品质量计量检测中心（巴彦淖尔市天赋河套质量标准检验研究中心）、内蒙古自治区质量和标准化研究院。本文件主要起草人：JIUHUAN FENG（冯九焕）、唐顺学、陈海军、李昊佼、李新、刘劼、邬冬梅、秀芳、侯敏、魏志恒、白君君、王祉诺、贾向春、靳存旺。DB15/T 27852022 1 食用向日葵品种纯度鉴定 SNP 标记法 1 范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记进行食用向日葵（Helianthus annuus L.）品种
3、纯度鉴定的术语定义、原理、仪器设备及耗材、试剂及溶液配制、检测程序、数据采集和结果分析、鉴定结果报告等要求。本文件适用于食用向日葵品种的纯度鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。品种纯度 varietal purity
4、 品种在特征特性或DNA分子标记基因型方面一致性的程度。通常用供检样品中本品种的个体数占检测样品个体总数的百分率表示。异型个体 off-type individual 供检样品中，与本品种在DNA标记位点或一个或多个遗传性状上存在差异的个体。单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism（SNP）基因组中基于单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。推荐标记 recommended markers 品种纯度鉴定中优先选用的具有良好基因型分型质量的标记组合。DB15/T 27852022 2 竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应 kompetitive allele s
5、pecific PCR（KASP）通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板，实现SNP基因型分型的聚合酶链式反应。基因型分型 genotyping 通过检测方法确定某品种(或遗传材料)的基因、DNA区段或遗传标记的基因型。4 原理 不同向日葵品种的基因组间存在核苷酸序列差异，其中单核苷酸（A、C、G、T）多态性(SNP)在基因组内分布广泛、密度高，这种差异可以通过荧光标记的 KASP 基因型分型等技术进行检测。利用一套多态性高、具良好基因型分型质量的推荐标记，检测供检样品中不同个体间的基因型差异，统计供检样品中异型个体数，从而对供检样品整体的遗传一致性程度进行测算，判定品种的纯度。5 仪器设
6、备及耗材 主要仪器设备及耗材为：实时荧光定量 PCR 仪、全自动样品快速研磨仪、高速离心机、核酸浓度测定仪、微孔板离心机、微量移液器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酸度计、磁力搅拌器、电子天平、冰箱等；96 孔深孔板、384 孔 PCR 板（白色）、微量离心管、普通枪头、封板膜、钢珠等。6 试剂及溶液配制 试剂要求 6.1.1 所用试剂至少为分析纯或分子生物学纯。试剂配制用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水要求。6.1.2 所需试剂为十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、醋酸铵、三氯甲烷、异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）
7、、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙醇、PCR Master Mix 等。溶液配制 6.2.1 2 mol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0）：称取 Tris 碱 242.8 g，溶于 850 mL 水中，加入浓盐酸调pH 至 8.0，定容至 1000 mL，高压灭菌。6.2.2 0.25 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）：称取 84.06 g Na2EDTA2H2O，溶于 900 mL 水中，加固体 NaOH（约 20 g）调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL，高压灭菌。6.2.3 10%SDS 溶液：称取 100 g SDS，加水定容至 1000 mL。6.2.4 溶
8、液 I：取 2 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.25 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）、10%SDS 各 100 mL，加水 900 mL，调 pH 至 8.0，定容至 1000 mL。用时按 2%（M/V）加入聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVP-K30）。6.2.5 溶液：取 500 g 醋酸铵固体，加水定容至 860 mL，抽滤后放 4 冰箱备用。6.2.6 2KASP Master Mix：包括 Taq DNA 聚合酶、通用荧光引物、dNTP、镁离子、ROX 内参荧光染料。DB15/T 27852022 3 6.2.7 KASP 引物：包括 10 M Primer
9、_Allele X、10 M Primer_Allele Y、10 M Primer_Allele C。7 检测程序 样品准备 7.1.1 供检样品可以为种子或幼叶。7.1.2 除供检样品外，必要时应提供对照品种、其亲本或亲本之一的样品。7.1.3 供检样品为种子时，重量应不低于 500 g。7.1.4 从供检样品分取规定数量的试样用于检测，试样的分取应符合 GB/T 3543.2 的要求。7.1.5 依据需达到的品种纯度的国家规定的质量标准，试样数量应符合 GB/T 3543.5 的规定，或通过Seedcalc8 计算。比如，在 95%置信水平，要达到 96%、98%、99%以上纯度质量标准
10、，每个样品需检测的种子数应分别不少于 100 粒、200 粒、400 粒。DNA 提取 DNA提取采用下列方法，其它能达到后续操作质量要求的DNA提取方法均适用于本文件：切取向日葵种子约 1/3（通常选取非胚芽一端），或剪取叶片 0.5 cm1 cm 大小，放入 96深孔板中，每孔 1 个样品。放入 4 mm 钢珠，加 100 L 溶液 I，用全自动样品快速研磨仪 50 Hz 研磨 60 s，重复 23 次，使样品完全破碎；于 4000 rpm 离心约 3 min，小心打开胶盖（注意避免样品间污染）。加 500 L 溶液，盖上胶盖，颠倒摇匀，65 恒温水浴 30 min50 min；加 300
11、 L 溶液 II，颠倒摇匀后，于 3600 rpm 离心 20 min；取上清液 300 L 移入新的 96 深孔板，加入 0.6 倍体积预冷的异丙醇，盖上胶盖，颠倒混匀，-20 静置 10 min。4000 rpm 离心 15 min，弃去上清液(勿使 DNA 倒掉)；加入约 300 L 70%乙醇，盖上胶盖，颠倒摇匀后 4000 rpm 离心 15 min。70%乙醇重复洗涤一次，方法同上；室温放置晾干，待 DNA 充分干燥后，加 200 L ddH2O 充分溶解，4 保存备用。PCR 检测 7.3.1 总则 7.3.1.1 依据检测目的，统筹考虑检测规模和成本，确定适宜的样品检测数量及标
12、记数量。7.3.1.2 配制反应体系时，每板应同时设置 2 个无 DNA 模板阴性对照（NTC）。根据 NTC 信号强弱，判断最适扩增循环数。若 NTC 信号过高，则应降低扩增循环数。7.3.2 推荐标记 推荐标记筛选原则及使用要求如下：选择遗传多态性高、基因组上分布均匀、基因型分型质量好、以及重复稳定性好的标记；本文件优先选用了 17 个 SNP 分子标记作为推荐标记（见附录 A），用于检测所有试样个体的基因型；对于仍处于遗传分离或不稳定的标记位点应予以剔除。若 17 个推荐标记中，有 3 个以上标记位点出现严重的遗传分离，可终止该样品的纯度鉴定。7.3.3 实时荧光定量 PCR 反应体系
13、DB15/T 27852022 4 7.3.3.1 本文件推荐以下反应体系，其它兼容 KASP 的检测体系均适用于本文件。依据 PCR 缓冲液类型、微孔板类型及检测平台，试验条件可做相应调整。7.3.3.2 PCR 扩增反应体系参照表 1 进行配制，其中 2KASP Master Mix 含有 dNTP、Taq DNA 聚合酶、通用荧光引物及 ROX 荧光内参。表1 PCR 扩增反应体系 成分 原浓度 终浓度 推荐用量（L）DNA 25 ng/L50 ng/L 7.5 ng/L15 ng/L 1.20 2KASP Master Mix 2 1 2.00 Primer_Allele X 10 M
14、 0.15 M 0.06 Primer_Allele Y 10 M 0.15 M 0.06 Primer_C 10 M 0.40 M 0.16 ddH2O-0.52 总体积-4.00 7.3.4 实时荧光定量 PCR 反应程序 荧光定量PCR反应通常采用下列程序：预变性：94 预变性 15 min；梯度 PCR：94 变性 20 s，65 退火和延伸 60 s（每循环降低 0.8），10 个循环；扩增：94 变性 20 s，57 退火和延伸 60 s，荧光信号读取，30 个循环。注：以上为推荐的基于实时荧光定量PCR仪检测平台的扩增程序，其它如Genomics SNP Line、Array T
15、ape、微流控芯片等利用KASP技术实现基因型分型的检测平台同样适用于本文件。8 数据采集和结果分析 数据采集 8.1.1 采用实时荧光定量 PCR 仪提供的数据分析软件，对每一标记产生的 SNP 荧光信号和基因型分型值进行分析。8.1.2 按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)无特异性扩增的原则，保留或剔除该位点的数据。若一个标记的缺失数据率大于等于 5%，需重做；单一个体检测成功率大于等于 98%，若某个体的缺失标记位点数大于等于 2 个，该个体数据则不予采用。8.1.3 数据记录为 X/Y。其中，X、Y 为同一位点上两个不同的等位变异，即纯合基因型记录为 XX 或YY，杂合基因型记录为
16、XY；缺失位点记录为-/-。结果分析 8.2.1 当供检样品中某个体在 2 个或 2 个以上标记位点与本品种标准基因型存在差异时，判定该个体为异型个体。8.2.2 品种纯度按照下列公式计算：品种纯度(%)=(检测个体总数-异型个体数)/检测个体总数100%8.2.3 判定杂交种的品种纯度是否达到国家规定的质量标准、合同和标签标注指标要求，使用 GB/T 3543.5 规定的容许差距，容许差距按式（1）计算。T=1.65 /（1）DB15/T 27852022 5 式中：T容许差距；p品种纯度的标准规定值；q100-p；N检测试样总数，单位为个。8.2.4 判定亲本或原种的品种纯度是否达到国家规
17、定的质量标准、合同和标签标注指标要求，可按照GB/T 3543.5 的规定，使用淘汰值判定。淘汰值可以通过 Seedcalc8 或如下式（2）计算：R=X+1.65+1.8（2）式中：R淘汰值（结果舍去所有小数位数，不采用四舍五入或六入）；X标准所换算成的异型个体数，单位为个。9 鉴定结果报告 品种纯度检测结果可按下列方式填报：对编号为 供检样品，采用 检测平台，利用 个推荐标记进行纯度检测。结果显示：在 份供检样品中，份为异型个体，该供检样品的纯度为 。具体检测结果可填入表 2。表2 品种纯度鉴定结果 供检样品编号 供检样品类型 推荐标记数 供检样品数 异型个体数 纯度 注：供检样品存在遗传
18、不稳定或严重分离的标记位点为：DB15/T 27852022 6 A A 附录A （规范性）推荐引物序列及基因组位置 17个推荐标记的KASP引物序列及基因组位置信息见表A.1。表A.1 推荐引物序列及基因组信息 标记ID LG Primer_Allele X/Ya(5-3)Primer_Allele C(5-3)基因组位置b PCP01 1 GCACACGCAGAGCACCTACTT GCACACGCAGAGCACCTACTC GTGTAAGATGTGGTAGACGCAGCTT 144989472 PCP02 2 GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGT GCATATTAACAG
19、GCAAGAACACTTGC GTCTGTAATGATCTTGCAGCTGCGAA 144865512 PCP03 3 GAAATTCCGGTCCCGCATTCCAT AAATTCCGGTCCCGCATTCCAC GGACTTTGGTTTTGAGGATCGGTGAA 113166971 PCP04 4 GGCTTACCATCTTGACATTATGGGTT GCTTACCATCTTGACATTATGGGTG TATGGCATCAACGAGGTATCCAGATAATA 456506 PCP05 5 CAAGGGTTGTATACAACACAAAGGCA AAGGGTTGTATACAACACAAAGG
20、CG CAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCAAATCCAA 154220962 PCP06 6 ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTT GTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTG CACCTTAACGATATTAACCCGATGGTTAT 38051242 PCP07 7 TACGATGACGTTGTGGAACGACTT CGATGACGTTGTGGAACGACTC GCCTGATTTTAGATGGATCGTCTAAGTTT 115935118 PCP08 8 GAGAGCGAGTTCACCAACATAATGT AGAGCGAGTTCACCAACATAATGC C
21、CACGGTTGAACCCTGATACTTGTT 48738858 PCP09 9 GCATCATCAAAGAATCGAGCTAGCA CATCATCAAAGAATCGAGCTAGCG AATTAAATTTCATTATGCTAGCTGACT 137888783 PCP10 10 CAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAT AAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAC CGAAACCTTGTGAAACTTGTTGGTTACTA 27896920 PCP11 11 ATCTTTGACACCACCAAACTCTAGTAT CTTTGACACCACCAAACTCTAGT
22、AC GTACATCCAAGGTTATGAAGACGCGAT 17635352 PCP12 12 GATAATGGTTTCCCGGTCGAAGAAA ATAATGGTTTCCCGGTCGAAGAAG ACCGAACCGGCTCCTCCGTAAT 26783877 PCP13 13 GATAACGAAAGATCACACCGGGAT ATAACGAAAGATCACACCGGGAC CACTGGACCCACCGTGAGACTT 156633180 PCP14 14 GGCCGTGAAGTTGAAGGATAGGT GCCGTGAAGTTGAAGGATAGGC CCATCTAACCTATCCCTGATC
23、CCAT 132691300 PCP15 15 GTTAGACGAAGACGATAAGGTTATGTTA AGACGAAGACGATAAGGTTATGTTC GAAACTGGCAGCTTCATGACCCAAT 6702056 PCP16 16 CAGCTCCCTGCAACTCAACCTA AGCTCCCTGCAACTCAACCTG GATAGAGGTGCGGCACTTGAAGTAA 3933425 PCP17 17 AAATGAAGATAAGTTACTCTTGGCAAGAA ATGAAGATAAGTTACTCTTGGCAAGAG GAACGGATACTTTGCTGGCCGTTTA 192170594 a 每组引物上面序列是Primer_Allele X，下面序列是 Primer_Allele Y。SNP位点用下划线标注。b 参照向日葵基因组版本HanXRQr2.0(https:/www.heliagene.org/)。DB15/T 27852022 7
