1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31512023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA 提取技术规程 Technical procedures for preparation by enzyme digestion method and RNA extraction of bovine mammary epithelial cells 2023-08-25 发布2023-09-25 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 31512023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的
2、结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：宋洁、王丽芳、胡耀、张腾龙、郭晨阳、钟华晨、刘嘉琳、杨健、狄彩霞、羿静、肖豆鑫、吴海霞、王春和、田志国、王利平、高新发、王晓辉、常月明、杨竹鸣、石文奎、褚文彬、马跃。DB15/T 31512023 1 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA 提取技术规程 1 范围 本文件规定了奶牛乳腺上皮细胞培养及其RNA提取和质量鉴定的方法。本文件适用于型胶原酶法制备奶牛乳腺上皮细胞及其RNA提取和质量鉴定。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件
3、。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。奶牛乳腺上皮细胞 bovine mammary epithelial cells 奶牛乳腺组织中唯一可以合成和分泌乳汁的高度分化的功能细胞。角蛋白-18 cytokeratin18（CK18）上皮细胞特有的标志蛋白。4 试剂和材料 试验试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、青链霉素混合液（含有10000 unit/mL青霉素和10000 ug/mL链霉素）、胰岛素转铁蛋白硒、氢化可的松、两性霉素B、表皮生长因子、胶原酶、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）、75%酒精、4%多聚甲醛、0.3%曲拉通（Trit
4、onX100）、5%正常山羊血清、兔抗角蛋白18抗体、山羊抗兔IgG、4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、甘油、TRNzol裂解液、氯仿、异丙醇、无水乙醇、ddH2O、西班牙琼脂糖、50TAE、DNA片段标准参照物（DNA Marker DL 5000）、通用电泳加样缓冲液（6Loading Buffer）、核酸染料、反转录试剂盒、实时荧光定量（RT-PCR）试剂盒。试剂配制 4.2.1 3PBS 缓冲液：1PBS 缓冲液（500 mL）中加入 3 mL 青链霉素混合液，4 低温保存。4.2.2 6PBS 缓冲液：1PBS 缓冲液（500 mL）中加入 6 mL 青链霉素混合液，4 低温
5、保存。DB15/T 31512023 2 4.2.3 型胶原酶（0.5%）：称取 75 mg型胶原酶，在灭菌烧杯中加 15 mL PBS 缓慢吹打溶解，0.22 m 针式过滤器过滤，现配现用。4.2.4 氢化可的松（0.1 mg/mL）：1 mg 氢化可的松溶于 1 mL 乙醇溶液中，充分混匀至粉末完全溶解，用 1PBS 定容至 10 mL，用 0.22 m 滤膜过滤后，按每管 1 mL 分装，封口冻存于-20。4.2.5 两性霉素 B（2.5 mg/mL）：25 mg 两性霉素 B 粉末溶于 10 mL 三蒸水中，吹打溶解后用 0.22m 针式过滤器过滤，按每管 1 mL 分装，封口冻存于-
6、20。4.2.6 表皮生长因子（10 g/mL）：将 0.1 mg 的表皮生长因子溶解在 10 mL 的 PBS 中，按每管 1 mL 分装，封口冻存于-20。4.2.7 完全培养基：将 90 mL DMEM/F12 培养基、10 mL FBS、4 mL 青链霉素、0.5 mL 胰岛素转铁蛋白硒、0.1 mL 氢化可的松（4.2.4）、0.1 mL 两性霉素 B（4.2.5）、10 L 表皮生长因子（4.2.6）加入250 mL 蓝盖瓶，混匀后 4 保存。4.2.8 消化终止培养基：8 mL DMEM/F12 培养基中加入 2 mL FBS 混匀，现配现用。4.2.9 细胞冻存液：8 mL D
7、MEM/F12 培养基中加入 1 mL FBS、1 mL DMSO 混匀，现配现用。4.2.10 1TAE：1 mL 50TAE 加 49 mL ddH2O，定容后混匀。4.2.11 琼脂糖凝胶（1%）：250 mL 三角瓶中称 0.3000 g 琼脂糖，加入 30 mL 1TAE 缓冲液（4.2.10）。4.2.12 琼脂糖凝胶（2%）：250 mL 三角瓶中称 0.6000 g 琼脂糖，加入 30 mL 1TAE 缓冲液（4.2.10）。试验材料 酒精灯、0.22 m针式过滤器、25 cm2透气细胞培养瓶、6孔细胞培养板、瓷盘、15 cm镊子、眼科镊、眼科剪、手术剪、5 mL无菌无酶样品管
8、、15 mL无菌无酶离心管、1.5 mL无菌无酶离心管、250 mL烧杯、250 mL蓝盖瓶、细胞冻存管、80目滤网、14 mm无菌细胞爬片、载玻片、无菌无酶枪头（10 L、200L、1 mL、5 mL）。仪器设备 天平（感量为0.0001 g）、生物安全柜、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌锅、倒置显微镜、低速离心机（转速不低于1300 rpm）、高速冷冻离心机（转速不低于12000 rpm）、4 冰箱、-80 冰箱、酶标仪、凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、制胶板、移液枪、血细胞计数板。5 奶牛乳腺上皮细胞培养 原代培养 5.1.1 选取健康奶牛活体或屠宰后，采集色泽亮白的深层乳腺组织，迅速带回实验室。
9、5.1.2 将乳腺组织置于已用 75%酒精擦拭消毒的搪瓷盘中，去除乳腺表层组织，避开泌乳导管和结缔组织部位，剪取 1 cm3左右的深层腺泡，置于 6PBS 缓冲液（4.2.2）中浸泡 10 min，并清洗至溶液中无乳汁后，放入超净台。5.1.3 在超净台中点燃酒精灯，依次摆放 7 个 250 mL 灭菌烧杯，从左往右分别倒入 3 杯 150 mL 3PBS 缓冲液、1 杯 75%酒精、3 杯 3PBS 缓冲液（4.2.1）。5.1.4 用灭菌长柄镊子夹取组织块，按序在 7 个烧杯中清洗 30 s 后转移至无菌一次性培养皿中。5.1.5 在培养皿中再次剪去乳腺组织块表皮，剪取约 2 mL 组织块
10、（1-2 mm3/块）至于 5 mL 样品管中，用眼科剪将组织块剪至糊状。5.1.6 加入等量 0.5%型胶原酶（4.2.3），颠倒混匀，放入 37 恒温培养箱中消化 1 h。5.1.7 消化结束后，于 80 目滤网上过滤消化液，并将滤液转移到 15 mL 离心管中，1300 rpm 离心 3 DB15/T 31512023 3 min。弃上清，用 5 mL 3PBS 缓冲液重悬，1300 rpm 离心 3 min，重复 12 次。5.1.8 细胞沉淀中加入 5 mL 完全培养基（4.2.7），吹散后移入 25 cm2 细胞培养瓶里，置于 5%CO2、37 恒温培养箱中培养。5.1.9 培养第
11、 5 天，取出培养瓶在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，贴壁后更换完全培养基，此后每2 天换一次液。传代培养 5.2.1 倒置显微镜下观察细胞长满至 80%以上后取出，弃上清，加入 5 mL 3PBS 清洗。5.2.2 加入 1 mL 0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃 30 s60 s，弃上清，加入 5 mL 3PBS 清洗一次，去除成纤维细胞。5.2.3 再加入 2 mL 0.25%胰蛋白酶后放入 37 恒温培养箱中消化 8 mim，显微镜下观察细胞脱壁呈亮圆点时，加入 2 mL 终止培养基（4.2.8）终止消化。5.2.4 轻柔吹打培养瓶底后转移至 15 mL 离心管中，1300 rpm 离心 3
12、 min。5.2.5 弃上清，加入 5 mL 3PBS 缓冲液重悬，1300 rpm 离心 3 min。5.2.6 弃上清，在细胞沉淀中加入 5 mL 完全培养基吹打混匀，移入 25 cm2细胞培养瓶里，置于 5%CO2、37 恒温培养箱中培养。冻存 将传代后的细胞进行冻存。将细胞用0.25%胰蛋白酶消化8 min，3PBS洗涤并离心后，加入1 mL细胞冻存液（4.2.9），封口后置于细胞冻存盒中，迅速冻存于-80。复苏 5.4.1 使用细胞时，将细胞从-80 冰箱取出，并迅速（90 s 内）在 37 水浴锅中晃动融化，再转移到 15 mL 离心管中，加入 1 mL 完全培养基，1300 rp
13、m 3 min 离心获得细胞沉淀。5.4.2 用 PBS 洗涤细胞 12 次，1300 rpm 离心 3 min 弃上清，加入 5 mL 完全培养基悬浮细胞，转移至 25 cm2细胞培养瓶，置于 5%CO2、37 恒温培养箱中培养。接板 将细胞用0.25%胰蛋白酶消化8 min，3PBS洗涤并离心后，采用血细胞计数板计数，以1105/mL 密度将细胞接种于6孔细胞培养板，每孔加2.5 mL完全培养基培，每24 h换完全培养基。细胞汇合度达80%时进行试验处理。角蛋白-18 鉴定（免疫荧光法）5.6.1 先将 14 mm 无菌细胞爬片平放于未接种细胞 6 孔板底，按照 5.5 方法处理细胞，待细
14、胞爬片上细胞汇合度达 80%时，吸弃 6 孔板上清，用 3PBS 洗涤细胞爬片。5.6.2 细胞爬片用 4%多聚甲醛于冰上固定 15 min，并用预冷 PBS 洗涤 2 次，每次 5 min。5.6.3 用 0.3%TritonX100 处理 5 min，PBS 清洗 3 次，5 min/次。5.6.4 在 37 下用 5%正常山羊血清封闭 1 h 后，滴加兔抗角蛋白 18 抗体（1:100 稀释）,在 4 下孵育过夜，并用 PBS 洗涤 5 次，5 min/次。5.6.5 滴加山羊抗兔 IgG（1:200 稀释），于 37 避光振荡孵育 1 h，用 PBS 洗涤 3 次，5 min/次。5.
15、6.6 DAPI 避光孵育 2 min。最后用甘油封片于载玻片上，立即在倒置荧光显微镜下观察（见附录 A）。6 乳腺上皮细胞总 RNA 提取及质量鉴定 DB15/T 31512023 4 总 RNA 提取 6.1.1 将铺满 6 孔板的细胞上清液弃去，3PBS 缓冲液冲洗。6.1.2 加入 1 mLTRNzol 裂解液，吹打混匀后,静置 5 min，吸入 1.5 mL 无菌无酶离心管中，充分震荡后静置 5 min，12000 rpm 4 离心 5 min。6.1.3 转移上清于新的 1.5 mL 离心管中，加入 200 L 氯仿萃取 RNA，充分震荡混匀后静置 5 min，12000 rpm
16、4 离心 15 min。6.1.4 小心吸取上层水相于新的 1.5 mL 无菌无酶离心管中，加入等体积异丙醇上下颠倒混匀后静置10 min，使 RNA 沉淀，12000 rpm 4 离心 10 min。6.1.5 弃上清，加入 1 mL 75%乙醇，轻柔晃动后静置 1 min2 min，12000 rpm 4 离心 5 min。6.1.6 小心吸弃上清液，晾干后加 ddH2O 20L40L。RNA 纯度检测 使用酶标仪核酸定量功能检测RNA纯度。将酶标仪专用Nanoquant板用ddH2O校准后，RNA点样2 L，测定RNA纯度。核酸的紫外吸收高峰为260 nm，蛋白质的紫外吸收高峰为280
17、nm。判断结果见附录A。RNA 质量检测 6.3.1 微波炉加热 1%琼脂糖凝胶（4.2.11）约 30 s，待溶液透明澄清取出，晾到 60 70 后，加 2 L 核酸染料，摇匀。6.3.2 先插入梳子，再倒胶，厚度 3 mm5 mm，避免气泡。6.3.3 将制好的胶放入电泳槽，点样孔位于负极处，倒入 1TAE 缓冲液（4.2.10），高出胶面 1 mm。6.3.4 将 5 L RNA 样品与 1 L 6loading buffer 混匀后加样 5 L，并以 DNA Marker DL 5000 作为对照。6.3.5 打开电泳仪开关，设置电压 120 v，时间 18 min。6.3.6 当条带
18、电泳到一半时停止，于凝胶成像仪照胶观察。完整的 RNA 电泳图谱中 28 s 和 18 s 两条带明亮且边缘清晰，28 s 条带的亮度约为 18 s 条带的 2 倍，5 s 条带亮度比较低，则认为 RNA 质量较好（见附录 A）。7 乳腺上皮细胞分泌功能鉴定（s1-酪蛋白 RT-PCR 产物电泳法）引物设计 根据GeneBank(NCBI)中的s1-酪蛋白基因编码区序列，设计引物。RT-PCR 产物电泳检测 提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA，并进行质量鉴定（6）。用反转录试剂盒和RT-PCR试剂盒进行扩增反应，扩增产物于2%琼脂糖凝胶（4.2.12）、4-10 V/cm电压条件下，电泳20 min
19、，检测s1-酪蛋白目的基因CSN1S1片段大小。DB15/T 31512023 5 A A 附录A （规范性）奶牛乳腺上皮细胞鉴定及 RNA 质量鉴定 A.1 奶牛乳腺上皮细胞角蛋白-18 鉴定见图 A.1。图A.1 奶牛乳腺上皮细胞角蛋白-18 鉴定 注：A：蓝色荧光标记的细胞核；B：红色荧光标记的角蛋白-18；C：合图。A.2 RNA 纯度判定标准见表 A.1。表A.1 RNA 纯度判定标准 项目 范围 结果 OD260/0D280 值 1.82.0 RNA 纯度较好 2.0 RNA 存在降解 A.3 奶牛乳腺上皮细胞 RNA 电泳图谱见图 A.2。图A.2 奶牛乳腺上皮细胞 RNA 电泳图谱
