1、ICS 65.020.30 CCS B 44 DB36 江西省地方标准 DB 36/T 19022023 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌荧光定量 PCR 检测方法 Laboratory animalreal-time quantitative PCR method for examination of pasturella pneumotropica 2023-12-11 发布 2024-06-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布DB36/T 19022023 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.2 5 设备和材料.2 6 试剂.2 7
2、 检测流程.2 8 结果判定.4 附录 A（规范性附录）溶液配制方法.5 附录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 的引物与探针.7 附录 C（规范性附录）荧光定量 PCR 检测方法.8 参 考 文 献.9 DB36/T 19022023 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：熊莉娟、周银平、张陆兵、肖芳平、万筱荣、贾菠、刘欢、罗勇兵、李建昌、周剑。D
3、B36/T 19022023 1 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物嗜肺巴斯德杆菌荧光定量PCR检测的术语和定义、缩略语、设备和材料、试剂、检测流程和结果判定等内容。本文件适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔中嗜肺巴斯德杆菌的检测，饲养环境中嗜肺巴斯德杆菌的检测参照执行。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14922 实验动物
4、微生物、寄生虫学等级及监测 GB/T 14926.12 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 39760 实验动物 安乐死指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 嗜肺巴斯德杆菌 pasturella pneumotropica 属于巴斯德菌科，巴斯德菌属，为革兰阴性，无动力，无芽孢的小杆菌。主要有两种生物型，分别是 Jawetz 型和 Heyl 型。3.2 荧光定量聚合酶链式反应 real-time quantitative polymerase chain react
5、ion;real-time PCR 在常规 PCR 的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的 53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着 PCR 反应的循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。3.3 DB36/T 19022023 2 Ct 值 cycle threshold value 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设
6、定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)Taq酶:Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)5 设备和材料 5.1 设备 设备包括但不限于：高压灭菌锅、荧光定量 PCR 仪、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、漩涡振荡器、组织匀浆器、生物安全柜、超净工作台、冰箱（4、-20、-80）、微量移液器（0.2 L2 L、2 L20 L、20 L200 L、100 L1 000 L）。5.2 材料 灭菌离心管（0.2 m
7、L、1.5 mL、5 mL、15 mL）、灭菌吸头、灭菌PCR扩增反应管、剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。6 试剂 6.1 本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。6.2 灭菌 PBS 溶液（配制方法见附录 A 中 A.1）。6.3 乙酸钾溶液（配制方法见附录 A 中 A.5）。6.4 裂解液（配制方法见附录 A 中 A.6）。6.5 蛋白酶 K 溶液（配制方法见附录 A 中 A.7）。6.6 Tris-饱和酚（pH7.8）。6.7 氯仿/异戊醇（241）：将氯仿和异戊醇按照 241 的比例配制。6.8 TE 缓冲液（配制方法见附录 A 中 A.8）。6.9 7
8、0%乙醇（配制方法见附录 A 中 A.9）。6.10 无水乙醇：-20 预冷。6.11 细菌基因组 DNA 抽提试剂盒：商品化试剂盒。6.12 荧光定量 PCR 试剂盒：商品化荧光定量 PCR 试剂盒。6.13 引物和探针序列（见附录 B 中 B.1）。6.14 阳性对照（嗜肺巴斯德杆菌 DNA）。6.15 阴性对照（不含嗜肺巴斯德杆菌的 DNA）。7 检测流程 7.1 生物安全要求 DB36/T 19022023 3 实验操作及处理按照GB 19489的规定执行。检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2中的要求执行。采样参照GB 14922中的要求执行。7.2 样品采集 7.
9、2.1 脏器组织 按照GB/T 39760的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的鼻咽部组织、气管组织或肺脏，剪取待检样本2.0 g于无菌15 mL离心管中，密封、编号，待检。7.2.2 嗜肺巴斯德杆菌分离培养物 可以直接使用GB/T 14926.12分离培养法中嗜肺巴斯德杆菌血琼脂培养基的培养物作为检测样本，用接种环刮取2个菌落装于无菌5 mL离心管中，密封、编号，待检。7.2.3 实验动物垫料 取1.0 g实验动物垫料置于15 mL离心管中，密封、编号，待检。7.2.4 实验动物设施设备 用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15 mL离心管中，密封、编
10、号，待检。7.3 样品处理 7.3.1 脏器组织 在生物安全柜内用灭菌剪刀将脏器组织剪碎后，加入4 mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆2 min，然后将组织悬液在4，3 000 g离心10 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。7.3.2 嗜肺巴斯德杆菌分离培养物 向装有样品的离心管中加入4 mL灭菌PBS，振荡至菌体彻底悬浮，编号备用。7.3.3 实验动物垫料和实验动物设施设备 向装有样品的离心管中加入4 mL灭菌PBS(垫料或棉拭子需全部浸泡于液体中)。密封后浸泡10 min，充分混匀，静置30 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。7.4 样本存放
11、 采集或处理的样本在2 8 条件下保存应不超过24 h，若需长期保存，应放置于-80 冰箱保存，避免反复冻融。7.5 样本 DNA 提取 7.5.1 样本 DNA 在实验室中提取步骤如下：a)取 350 L 已处理好的样品加入 350 L 裂解液，然后加入 30 L 的蛋白酶 K 溶液，混匀，56 水浴 2 h 或 37 消化过夜；b)向消化后的裂解液中加入 70 L 乙酸钾溶液，混匀冰浴 10 min，4，12000 g 离心 10 min，取上清液转移至新的 1.5 mL 离心管；DB36/T 19022023 4 c)加入等体积的 Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀 10 min，4，120
12、00 g 离心 10 min；d)取上清液至新的离心管中，加入 0.5 倍体积的 Tris-饱和酚和 0.5 倍体积的氯仿/异戊醇（241），12000 g 离心 10 min；e)取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），12000 g 离心 10 min；f)取上清液至新的离心管中，加入 2 倍体积-20 预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，12000 g 离心 10 min，弃上清；g)加入 500 L 70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，12000 g 离心 3 min，吸去上清液；h)室温下放置 2 min 使残余乙醇完全挥发，加入 100 L TE 缓冲液溶解 D
13、NA 沉淀，即可用于检测或-20 保存备用。7.5.2 样本 DNA 也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6 荧光定量 PCR 检测 荧光定量PCR检测方法应符合附录C。8 结果判定 8.1 质控标准 阳性对照 Ct 值35，且出现对数扩增曲线。阴性对照及空白对照无 Ct 值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2 检测结果判定 符合8.1条件下，被检样本Ct值35，且出现对数扩增曲线，判定为阳性；被检样本无Ct值且无对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本35Ct值40时，重复一次，如果Ct值仍然40，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判
14、定阴性。DB36/T 19022023 5 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制方法 A.1 灭菌PBS溶液 准确称取氯化钠（NaCl）8.00 g，氯化钾（KCl）0.20 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24 g，磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）3.65 g，先加入 800 mL 去离子水溶解，调节溶液 pH 至 7.27.4，定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121)条件下灭菌 20 min，冷却备用。A.2 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入80 mL水中，充分搅拌，用氢氧化钠（N
15、aOH）颗粒调pH至8.0，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121)条件下灭菌20 min。A.3 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH 8.0)称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris)溶解于 800 mL 水中,用盐酸（HCl）调 pH 至 8.0,加水定容至1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min.A.4 5 mol/L氯化钠溶液 称取 29.22 g 氯化钠（NaCl）溶于 80 mL 水中，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min。A.5 裂解液 在约 700 mL 水
16、中，依次加入 10 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液、20 mL 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、80 mL 5 mol/L 氯化钠溶液。另称取 10g 十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa，SDS），混合后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定容至 1 000 mL，室温保存备用。A.6 蛋白酶K溶液 将 20 mg 蛋白酶 K（20U/mg）溶于 9.5 mL 水中，轻摇至完全溶解后，加水定容至 10 mL。于-20 保存备用。A.7 乙酸钾溶液（pH 4.8）称取 29.43 g 乙酸钾（KAc)溶于 60mL 水，用冰乙酸（HAc）调 pH 至 4.8,加水定容
17、至 100 mL。在103.4kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min。DB36/T 19022023 6 A.8 70%乙醇 取70ml无水乙醇，加入蒸馏水30ml，充分混匀后备用。A.9 TE缓冲液（pH 8.0）在约 800 mL 水中，依次加入 10 mL 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和 2 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液，用盐酸（HCl）调 pH 至 8.0,加水定容至 1000mL。在 103.4kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20min。DB36/T 19022023 7 B B 附 录 B（规范性附录）荧光定量 PCR 的引物与探针 B
18、.1 引物和探针序列 正向引物 5-CGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGT-3 反向引物 5-GGAGTTAGCCGGTGCTTCTTC-3 探针 Jawetz FAM-AATAAGGGTATTAACCTTATCACCTTCCTCATC-BHQ-1 探针 Heyl FAM-CAGCTTGGCTATTAACCAAACTGCCT-BHQ-1 注：探针可选用具有与FAM和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。DB36/T 19022023 8 C C 附 录 C（规范性附录）荧光定量 PCR 检测方法 C.1 荧光定量 PCR 反应体系 反应液的配制在冰上操作，每次反应同
19、时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以嗜肺巴斯德杆菌DNA 作阳性对照、不含嗜肺巴斯德杆菌的 DNA 作阴性对照、以灭菌去离子水作空白对照。表 C.1 每个荧光定量 PCR 反应体系 反应组分 用量 终浓度 Probe qPCR Mix（2）10L 1 正向引物（10mol/L）0.8L 400nmol/L 反向引物（10mol/L）0.8L 400nmol/L 探针（10mol/L）0.6L 300nmol/L DNA 模板 1L-灭菌去离子水 6.8L-总体积 20L-注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。C.2 荧光定量 PCR 反应条件 表 C.2 荧光定量 PCR
20、反应条件 步骤 温度 时间 采集荧光信号 循环数 预变性 95 2min-1 变性 95 15s-40 退火,延伸 57 60s 是 注：反应参数可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。DB36/T 19022023 9 参 考 文 献 1 Stojek NM,Dutkiewicz J.Studies on the occurrence of Gram-negative bacteria in ticks:Ixodes ricinus as a potential vector of Pasteurella.Ann Agric Environ Med.2004,11(2):319-22.2
21、 胡小琦,彭焕文,田巍威.人感染嗜肺巴斯德杆菌病例报告J.寄生虫病与感染性疾病,2017,15(01):52.3 Benga L,Benten WP,Engelhardt E,et al.Development of a multiplex PCR assay based on the 16S-23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodent PasteurellaceaeJ.J Microbiol Methods,2013,95(2):256-261.4 Gautier AL
22、,Dubois D,Escande F,et al.Rapid and accurate identification of human isolates of Pasteurella and related species by sequencing the sodA gene.J Clin Microbiol.2005 May,43(5):2307-14.5 Dole V S,Banu L A,Fister R D,et al.Assessment of rpoB and 16S rRNA genes as targets for PCR-based identification of Pasteurella pneumotropicaJ.Comp Med.2010,60(6):427-435.6 王立鹏,李永旺,王晨娟等.Dole qPCR检测嗜肺巴斯德杆菌的可靠性研究及在啮齿类实验动物质量监测中的应用J.现代检验医学杂志,2019,34(05):109-114._
