1、 ICS 65.020.20 CCS B16 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 21062023 芋疫病抗性室内离体接种鉴定技术规程 Code of practice for identification of taro to leaf blight in room 2023-09-27 发布2023-11-27 实施湖北省市场监督管理局发 布 DB42/T 21062023 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 操作流程.1 5 病原物分离与鉴定.1 6 接种体制备.2 7 室内离体接种鉴定方法.2 8 抗性鉴定评价标准.3 附录 A（资
2、料性）芋疫病典型病症，病原菌的形态描述和分子鉴定.4 附录 B（资料性）芋疫病抗性离体鉴定记载表.6 参考文献.7 DB42/T 21062023 III 前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由武汉市农业科学院提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：武汉市农业科学院、华中农业大学。本文件主要起草人：王直新、孙亚林、谢甲涛、黄新芳、柯卫东、朱红莲、刘玉平、董红霞。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-876658
3、21，邮箱：；对本文件的有关修改意见建议请反馈至武汉市农业科学院蔬菜研究所，联系电话：027-88116313，邮箱：。DB42/T 21062023 1 芋疫病抗性室内离体接种鉴定技术规程1 范围 本文件规定了芋疫病室内离体接种鉴定技术的接种体制备、室内离体接种鉴定方法、抗性评价标准、鉴定记载方法等基本要求。本文件适用于芋品种及种质资源对芋疫霉菌抗性的室内离体接种鉴定及评价。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 232
4、7农作物种质资源鉴定评价技术规范 芋 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。芋疫病 taro leaf blight 由芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae Racib.）侵染芋叶片、叶柄或球茎引起的病害。接种体 inoculum 用于接种以引起病害的病原物或病原物的一部分。4 操作流程 5 病原物分离与鉴定 病原物分离 从发病田间采集具有典型症状（见附录A.1）的新鲜病叶，采用常规植物病原菌分离方法分离芋疫病病原物。分离物经寄主范围、培养性状、回接发病症状、形态学特征确认为芋疫霉菌后，再进行分离纯化和致病性测定，保存备用。病原物鉴定 对用于抗病性接种鉴定的病原物进行
5、形态学鉴定、致病性鉴定和DNA分子鉴定，鉴定方法见附录A.2和A.3。病原物分离与鉴定 接种体繁殖 调查与病情分级 室内离体接种 鉴定评价 结果记载 DB42/T 21062023 2 6 接种体制备 接种体繁殖 在接种前进行病原物接种体的繁殖。将芋疫霉菌接种在V8培养基上（培养皿直径=90 mm），恒温培养箱中28 下暗培养7 d。菌丝长到培养皿边缘时，为保证接种时菌丝活力最强且较为一致，用打孔器（直径=5 mm）从菌落边缘打取菌丝块，菌丝块即为接种体。V8培养基的配制（1 L）：V8（番茄、胡萝卜、芹菜、红甜菜、欧芹、生菜、西洋菜、菠菜）混合蔬菜汁200 mL、CaCO3 2 g、蒸馏水8
6、00 mL、琼脂15 g，121 高压蒸汽灭菌20 min。接种体保存 准备试管V8培养基斜面，将待保存的菌株接种于斜面培养基上，待菌丝长满斜面后，置于4 8 或室温的条件下保存。每30 d转接保存1次。7 室内离体接种鉴定方法 鉴定材料准备 待鉴定芋材料种植于试验地应满足NY/T 2327的要求，定植60 d120 d后，在接种鉴定当天上午，从田间取新生的完全展开的第2片叶，叶片。叶片需健康，无伤口、虫害或病菌感染。叶片编号后带回室内，经75%酒精消毒，使用钢制模具从每个叶片相同部位切下2个直径80 mm的圆片，平铺在塑料盘中的湿纱布上。以福鼎芋为感病对照材料。鉴定材料按顺序或者随机排列，每
7、份材料重复3次，每一重复10个叶盘。接种方法 将供试菌株在V8培养基上培养7 d，用无菌的打孔器（直径=5 mm）从菌落边缘打取菌丝块，用镊子将菌丝块接种在叶盘中央位置，避开主叶脉，每个叶盘接种1个菌丝块。以接种空白V8培养基块的叶盘为空白对照。将叶盘置于塑料盘内的湿纱布上，用保鲜膜盖住塑料盘保湿，并每24 h用喷雾器适量补充灭菌水（水中含0.05%的吐温-20）一次。鉴定室保持28，相对湿度80%，黑暗条件培养24 h，然后调至每日光周期光照/黑暗时长分别设置为12 h/12 h。病情调查 7.3.1 调查时间 接种后96 h调查病情。7.3.2 调查方法及病情级别划分 对接种后的叶盘（加上
8、精度为1 mm的直尺作为标尺）进行拍照，使用图像分析软件测量标尺对应的像素和病斑的像素，换算为病斑实际大小。7.3.3 计算方法调查每份鉴定材料接种病原物后的发病情况，依据表1病情级别划分标准，逐份调查和登记病情级别，计算出病情指数（DI）。病情指数按式（1）计算：DB42/T 21062023 3 =()9 100 (1)式中：DI 病情指数；s 各病情级别的代表数值；n 各病情级别的病叶数；N 调查总叶片数。表1 病斑直径划分病情级别 病情级别 病斑直径（mm）0 病斑直径 5 1 5 病斑直径 10 3 10 病斑直径 20 5 20 病斑直径 30 7 30 病斑直径 40 9 病斑直
9、径 40 8 抗性鉴定评价标准 根据鉴定材料病情指数（DI）的平均值确定其抗性水平，当感病对照材料达到其相应感病程度（DI60），该批次的抗疫病鉴定即为有效，划分标准见表2。芋疫病抗性离体鉴定结果记录表格见附录B。表2 芋疫病抗性接种鉴定的评价标准 病情指数（DI）抗性评价 DI=0 免疫（I）0 DI 20 高抗（HR）20 DI 40 抗病（R）40 DI 60 中抗（MR）60 DI 80 感病（S）DI 80 高感（HS）DB42/T 21062023 4 A A 附录A （资料性）芋疫病典型病症，病原菌的形态描述和分子鉴定 A.1 芋疫病典型病症 芋疫病主要危害叶片、叶柄，严重时也危
10、害球茎。通常在降水、露水等条件下，叶片最易受害，开始时病斑呈黄褐色圆形小斑，随后逐渐扩大并融合成圆形或不规则轮纹大斑，病斑边缘有水渍状暗绿色环带，湿度大时病斑边缘出现白色粉状霉，并常伴随有坏死组织分泌的黄色至淡褐色的液滴。病斑发展呈现明显的昼夜模式，即晚上水渍状病斑扩展3 mm5 mm，白天边缘变干，依次循环形成年轮状病斑。病斑边缘形成大量孢子，从而肉眼可见白色粉末状（图A.1）。病斑相连时会使病叶变黑加速腐烂，病斑自中央腐烂穿孔，以致全叶坏死呈破雨伞状。一些感病品种的叶柄发生危害时会生出大小不等、形状不规则的黑褐色病斑，病斑连合环绕叶柄时可造成叶柄倒折（图A.2）。图A.1 芋疫病为害叶片症
11、状 图A.2 芋疫病为害叶柄症状 DB42/T 21062023 5 A.2 芋疫霉菌形态描述 芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae Racib.）属于卵菌门霜霉科疫霉属，孢子囊梗单根或数根从叶片气孔伸出，短而直，偶有分枝，梨形（3860）m （1926）m，无色，无隔膜；孢子囊顶生，单胞，梨形至长椭圆形，具柄；低湿度时萌生芽管，高湿度时产生无色、肾形游动孢子，一侧中部有双鞭毛，静孢子球形；吸器细长且无分枝，异宗配合类型，需要A1和A2两种交配型才能形成卵孢子。最适合菌丝体生长和游动孢子产生的培养基是V6和V8。菌丝体生长和游动孢子的最适温度为28，产生游动孢子的最适pH值
12、为6。黑暗和光照中都适合菌丝体生长和游动孢子形成。目前尚未发现芋疫霉菌的生理小种分化。A.3 芋疫霉菌分子鉴定 从培养基表面刮取芋疫霉菌新鲜菌丝，液氮研磨后，用CTAB法提取芋疫霉菌基因组DNA，并将DNA稀释至50 ng/L备用，用高保真DNA聚合酶来扩增内源转录间隔区（internally transcribed spacer,ITS）。采用通用引物ITS4 5-TCCTCCGCTTATTAGTATGC-3 和ITS5 5-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3来扩增芋疫霉菌的ITS。用50 L的反应体系，按如下组成配制：2 L模板DNA，10 L 5缓冲液，1 L DNA聚合酶
13、，5 L浓度为10 mM的dNTP，5.0 L引物混合液（按等体积混合10 mol/L ITS4上游引物和ITS5下游引物），27 L灭菌双蒸水。PCR的条件如下：98 预变性2 min；98 变性10 s，55退火15 s，68 延伸1 min，32个循环。取5 L的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的扩增阳性的PCR反应液委托测序公司进行测 序。测 序 结 果 去 除 两 端 质 量 差 的 碱 基 后 与 NCBI 数 据 库 进 行 BLAST（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对。DB42/T 21062023 6 B B 附录B
14、（资料性）芋疫病抗性离体鉴定记载表 表B.1给出了芋疫病抗性离体鉴定结果记载表格。表 B.1 芋疫病抗性离体鉴定结果记载表 编号 品种/种质名称 病情级别相应的发病叶盘数 病情指数 抗性评价 0 级 1 级 3 级 5 级 7 级 9 级 1.鉴定地点：2.定植日期：3.接种日期：4.接种病原菌分离物编号：5.调查日期：鉴定人：复核人:技术负责人（签字）:年 月 日 DB42/T 21062023 7 参考文献 1 王 娇 阳,洪 霞,米 敏 等.芋 疫 病 灾 变 规 律 及 综 合 防 治 研 究 进 展 J.安 徽 农 业 科学,2021,49(21):1-2+6.2 叶泉清,钟佳玲,陈媚等.槟榔芋疫霉菌生物学特性、致病力测定及田间防治药剂筛选J.南方农业学报,2016,47(04):588-593.
