1、ICS 65.020.20B 16DB6111杨 凌 农 业 高 新 技 术 产 业 示 范 区 地 方 标 准DB 6111/T 1492020猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程Detection of Living Pseudomonas syringae pv.actinidiae from Kiwifruit poLLen2020-10-15 发布2020-11-01 实施杨凌示范区市场监督管理局发 布DB6111/T 1492020I前 言本文件是依据GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本文件由西北农林科技大学提出。本文件由杨凌
2、农业标准化专业技术委员会归口。本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西省猕猴桃工程技术研究中心、杨凌现代农业产业标准化研究推广服务中心。本文件主要起草人：黄丽丽、徐亮胜、雷玉山、高小宁、冯浩、王娜娜。本文件由西北农林科技大学负责解释。本文件为首次发布。单位：西北农林科技大学电话：029-87091312地址：陕西省杨凌区邰成路西北农林科技大学邮编：712100DB6111/T 14920201猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程1范围本文件规定了猕猴桃花粉中活性溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa）检测方法的原理、检测方法、检测样品与菌株保存、结果
3、记录与资料保存的要求和内容。本文件适用于活性溃疡病菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T 23621-2009 农业植物检疫实验室基础条件SN/T 0168-2015进出口食品中菌落总数计数方法SN/T 0800.1-2016进出口粮油、饲料检验 抽样和制样方法3原理猕猴桃为雌雄异株植物，雌雄株之间必须通过授粉才能坐果，花粉中可以携带活性溃疡病菌。本文件利用常规
4、生物学鉴定方法和菌落PCR检测方法对花粉中溃疡病菌进行检测，为阻止猕猴桃细菌性溃疡病菌的传播提供技术支撑。4检测方法4.1实验室要求猕猴桃细菌性溃疡病菌检测所用实验室的设置与管理符合GB/T 236212009要求。除另有规定外，本标准中的所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB 6682中一级水的规格。病原菌培养及鉴定所需试剂见附录B。4.2检验程序及鉴定方法猕猴桃花粉Psa活菌检验程序见图1。4.2.1操作步骤4.2.1.1检测样品抽取见SN/T 0800.1-2016。4.2.1.2抽样数量DB6111/T 1492020210瓶（件）以下，逐瓶抽取，10瓶100瓶，随机选10瓶
5、抽取样品；100瓶以上，按照一批花粉总瓶数的平方根数抽取，见公式（1）。每瓶（件）抽取2 g花粉。.(1)式中：N一批花粉总瓶(件)数。n应抽取瓶（件）数（取整数，小数部分向上约）。图 1猕猴桃花粉 Psa 活菌检验程序4.2.2抽样方法无菌条件下将装花粉的容器充分震荡，使容器内花粉充分混匀；容器表面用75%乙醇在包装口擦拭消毒，待10 min15 min后，用无菌药匙取2 g花粉于无菌的10 mL离心管中，每瓶（件）花粉需换用1把药匙。-20 40 保存备用。4.2.3样品制备4.2.3.1制备样品匀液无菌操作称取1 g样品，加入装有9 mL的灭菌双蒸水的和适量玻璃珠的50 mL稀释瓶中，迅
6、速振摇，将样品混匀，制成1:10的样品匀浆液。振摇时振幅为30 cm，7 s内振摇25次，也可以用机械振荡器振荡15 s代替手摇。4.2.3.2稀释样品匀液无菌条件下取样品匀液1 mL加到9 mL稀释剂中，并以此类推，分别制成10-2、10-3、10-4连续稀释度或其它合适稀释度的样品匀液。4.2.4选择性培养基平板接种和培养检样稀释平板接种总菌落计数PCR 确认试验检测报告DB6111/T 149202034.2.4.1无菌条件下各取 1 mL 不同稀释度的样品匀液，均匀涂布在 KBA+萘啶酮酸（终浓度为 10 g/mL）平板培养基上。放入培养箱在 25 培养 1 h 后，翻转培养皿，倒置培
7、养 47 h。观察菌落形态和病原菌形态特征。猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征见附录 A 第 A.6 章，根据菌落特征选取可疑菌落做进一步鉴定。4.2.4.2KBA 培养基的配制方法为：在培养基中加入蛋白胨 20.0 g、硫酸镁（MgSO47H2O）1.5 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.5 g、甘油 10 mL、琼脂粉 15.0 g，并用灭菌双蒸水补充至 1000 mL，将 pH 值调整到 6.87.0。4.2.5菌落计数选择菌落数在25个250个的平板进行计数，计数所有菌落形成单位（CFU），包括极微小的菌落。记录菌落数和稀释倍数。如果不能立即计数，平板在0 4 存放时间不得超过24
8、 h。4.2.6PCR 检测4.2.6.1从已计数的平板中挑取单菌落进行 PCR 确认试验平板菌落数小于30个，需全部进行PCR确认；菌落数介于31个250个时，随机挑取30个菌落进行PCR确认试验。注：PCR实验室区的设置与管理符合GB/T 236212009要求。4.2.6.2热裂解法制备 DNA 模板用无菌牙签挑取平板上培养36 h48 h的单菌落，置于200 L的0.85%无菌生理盐水中，充分混匀；在13000 r/min 离心3 min，弃掉上清液；再加入1 mL灭菌双蒸水，充分混匀；置于100 水浴或金属浴中10 min；冰浴冷却后，13000 r/min离心3 min，收集上清液
9、；按1:10的比例用灭菌双蒸水稀释上清液即为DNA模板；取2 L DNA模板进行PCR检测。所有DNA模板可直接用于PCR反应或在4 保存1天。否则，应在-20 以下保存备用(1周内)。4.2.6.3阳性对照与阴性对照。用已知的Psa标准菌株（M228）作为阳性对照；用丁香假单胞杆菌番茄致病变种（Pst）或等效标准菌株作为阴性对照。灭菌双蒸水作为空白对照。PCR制样及检测方法见附录B的结果判定。4.2.7平板培养结果判定平板培养放置6 d以上,如未发现疑似细菌菌落，判定为不带有Psa。如发现疑似细菌菌落，进行菌落计数，并做进一步PCR鉴定。4.2.8PCR 结果判定若待测样品和阳性对照存在24
10、3 bp条带，阴性对照和空白对照无此条带，则判定待测样品为阳性，其携带有Psa；否则为阴性。5样品与菌株保存备份样品及从样品中分离到并鉴定为Psa菌株，应妥善保存。备份样品菌株可接种于KBA培养基斜面上，25 恒温培养2 d3 d后置于4 冰箱保存，或加入10%体积的甘油制成甘油菌液，置于-80 冰DB6111/T 14920204箱长期保存。其它不需要保存的样品及检测过程中产生的废物、废水等应经高压灭菌后集中销毁，用具也应进行灭菌处理。6结果记录与资料保存实验记录应包括：样品来源、种类（品种）、采集时间、检测时间、地点和结果等，并要有检测人员、审核人员签字。PCR检测需要有电泳结果照片等，上
11、述材料应归档并妥善保存。DB6111/T 14920205AA附录A（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌（psa）相关资料A.1英文名称Kiwifruit BacteriaL CankerA.2学名Pseudomonas syringae pv.actinidiaeA.3分布地区中国、日本、韩国、新西兰、意大利、美国、法国、葡萄牙、土尔其、西班牙、伊朗、希腊。A.4寄主范围该病原菌自然侵染的寄主主要为猕猴桃属（Actinidia LindL）；人工接种可侵染桃（Prunuspersica）、樱桃（Prunus avium）、李（Prunus saLicina）、烟草（Nicotiana taba
12、cum）、番茄（LycopersiconescuLentum）等。A.5病害症状A.5.1枝溃疡症状多从茎蔓幼芽、皮孔、叶痕、果柄痕及枝条分叉部位开始发病，初期呈水渍状，后扩大，颜色加深，皮层组织变软隆起，与木质部分离，后期病部皮层纵向线状龟裂，伤口、皮孔、芽眼、叶痕等部位流出白色黏液，伤流期与植株伤流液混合后变为红褐色或铁锈红色，剥开皮层后可见木质部呈黑褐色，韧皮部溃疡腐烂，病斑绕茎扩展到新梢后影响营养和水分的吸收与输送导致新梢枝叶萎蔫枯死。A.5.2叶斑症状新生叶片上呈现红色小点，后形成2 mm3 mm不规则褐色或暗褐色病斑，病斑周围有2 mm5 mm的明显水渍状黄色晕圈，潮湿条件下病斑扩
13、大，导致整个叶片焦枯、卷曲。A.5.3花腐症状花蕾受害后严重的不能张开，变褐死后脱落；受害较轻的花蕾虽能开放，但开放速度慢或不能完全开放，这种花可能脱落也可能座果，通常果实较小，易落果或发育成畸形果。A.6病原菌形态特征及培养性状DB6111/T 14920206Psa为好氧细菌，病原菌菌体直杆状，有的稍弯曲，单细胞，菌体大小为（1.4 m2.3 m）（0.4 m0.5 m），多数具1根极生鞭毛，少数为2根3根。革兰氏染色阴性，不具荚膜，不产生芽孢。在KBA培养基上菌落呈白色或浅黄色、表面光滑、有黄绿色荧光；在牛肉蛋白胨培养基上呈圆形、乳白色、表面光滑、全缘。病原菌生长最适温度为25 28，生
14、长最高温度为35，生长最低温度为-12 以下，致死温度为55、10 min。A.7传播途径该病原菌的远距离传播主要靠带菌苗木、接穗、花粉和昆虫。在田间，该病原菌主要通过雨水、灌溉水、农具、昆虫等传播，由伤口、自然孔口等侵入寄主组织。DB6111/T 14920207BB附录B（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌（psa）PCR 检测方法B.1试剂及配制TE 缓冲液：10 mM TrisHCL,1 mM EDTA,pH 8.0。PCR 试剂：特异引物对（10 moL/L）、2Master Mix、TempLate(0.1 ng/mL1 ng/mL)2000 bp DNA Marker、5 moL/
15、L NaCL、70%乙醇、核酸染料电泳缓冲液 TBE（5）（pH 8.0）：每升溶液中含 54 g Tris，27.5 g 硼酸，10 mM EDTA。电泳时稀释成 1浓度使用。琼脂糖凝胶（1%）：称取 0.1 g 琼脂糖加入到 10 mL 1TBE 溶液中，微波炉煮沸后加入 1体积核酸染料，混匀后制胶。B.2PCR检测B.2.1PCR检测引物引物对1：Psa-F1/Psa-R1（引物序列为正向引物P0F:5-CTGCAACAGGCGACGGCGAGGC-3、反向引物P6R:5-CATAGGCTTCTGGTTTTCTTCCTGATCC-3，扩增片段长度为243 bp），使用TE溶液（pH 8.
16、0）将合成的引物干粉稀释成10 moL/L 储存液。B.2.2PCR反应体系及扩增条件B.2.2.1PCR反应体系2Master Mix 10 L、TempLate(0.1 ng/mL1 ng/mL)1 L、正反引物各1 L、补灭菌双蒸水至反应体系总体积为20 L。B.2.2.2PCR扩增条件将配制完成的反应管放入PCR仪中，启动反应程序：94 预变性5 min；94 变性30 s，66 退火30 s，72 延伸1 min，35 cycLes；72 5 min，4 保温。在进行PCR检测时，需同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。注：本实验使用PCR试剂盒：2Master Mix（3 mmoL
17、/L MgCL2，0.2 mmoL/L dNTP，0.1 U/L Taq DNA PoLymerase，2PCR Buffer）B.3凝胶电泳称量2.0 g琼脂糖，加入至200 mL的1TAE电泳缓冲液中，充分混匀。微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60 左右时，加入GeLRed（胶体体积与染料体积比为20:1），充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于10 cm，厚度为3mm5 mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，如果有，则用一次性吸头小心排掉气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结后，轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔朝向阴极端。
18、向电泳槽中加入1TAEDB6111/T 14920208电泳缓冲液，液面高于胶面1 mm2 mm。用微量移液器吸5 L PCR产物加入上样孔中；其中，第1个泳道中加入2 L DNA Marker，阳性对照的PCR反应产物加入到最后1个泳道。接通电源,根据公式:电压=电泳槽正负极间的距离(cm)5 V/cm 计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关,电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准，电泳时间为30 min45 min。B.4成像观察与记录电泳结束后，取出琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下，根据DNA Marker判断扩增产物条带的大小，记录结果，并将电子文件存档备查。B.5结果判定如果待测样品和阳性对照
19、同时出现243 bp大小的目的条带，而阴性对照、空白对照均没有该条带，则判定待测样品为阳性；如果阳性对照出现目的条带，而阴性对照、空白对照、待测样品中均未出现目的条带，则判定待测样品为阴性。B.6结果报告B.6.1数字修约参见SN/T 0168-201进行计数。结果只报告前2位有效数字。当第3位数字是6,7,8,9时，即把保留的第2位数字加1，并且用0代替第2位数字右边的每一个数字；如果第3位数字是1,2,3,4时，则直接舍去位数；第3位数字是5时，如果5后面是奇数时则进位，是偶数则舍弃。B.6.2计算B.6.2.1总菌落数平板上的菌落在25-250个范围内，计算公式（B.1）：N=c/(1n1)+(0.1n2)d.(B.1)式中：N每克花粉中菌落数；c所有计数的平板的菌落数之和；n1计数的第1个稀释度的平板数；n2计数的第2个稀释度的平板数；d计数的最低稀释度。B.6.2.2Psa菌落数计算公式公式（B.2）：PN=N(n3/n4)100%.(B.2)式中：PN每克花粉中Psa菌落数;n3PCR确认实验中Psa阳性菌落数；n4PCR确认实验中抽取的总菌落数。数字修约后表示为810或8.1102DB6111/T 14920209即每克花粉中含有8.1102个Psa。B.7报告报告为每克花粉中含有多少个猕猴桃溃疡病菌，检出限为102 个/g花粉。_
