1、li叶E中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1022二2001出口食品中霍乱弧菌检验方法Method for the determination of vibrio cholerae in food for export 2001-12-30发布2002 - 06 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 1022-2001 前言本标准是按照GB/T1.1-1993标准化工作导则第1单元:标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定的要求编写的。其中技术路线等同引用美国食品与药品管理局(FDA)细菌学分析于册(1995年第8版)中的方法。本标准的附录A是标准的
2、附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:唐守亭、曹际娟、马勇。本标准首次发布。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准范围出口食品中霍乱弧菌检验方法Method for the determination of vibrio cholerae in food for export 本标准规定了出口食品中霍乱弧菌的检验方法。本标准适用于出口水产品及其他食品的检验。2 引用标准SN /T 1022 - 2001 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修
3、订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。SN 0330-1994 出口食品中微生物学检验通则3 抽样3- 1 抽样数量及抽样方法按SN0330进行。3- 2 .式样制备从1昆合样品中取出代表性样品，将可食部分(去除贝壳)充分混匀。用四分法缩分出不小于500g作为试样，装入灭菌容器内，加封后标明标记。3- 3 试样保存冷冻样品于一18C保存。冷藏样品于+4C保存，24h内检验。4 设备和材料4.1 均质器8000 r/mi口10000 r/min，附500mL均质杯。4.2 恒温培养箱:300C60C。4.3 显微镜。4.4 试管架。4.5 微生物实验室通用玻璃器皿、移液管、培养
4、皿等。5 培养基和试剂5.1 碱性蛋白陈水(APW)5.2 TCBS琼脂5.3 三糖铁琼脂(TSI)5.4 双糖铁琼脂(KIA)5.5 T)N1琼脂5.6 精氨酸葡萄糖斜面琼脂(AGS)5.7 Hugh-Leifson葡萄糖肉汤(HLGB)5.8 赖氨酸脱竣酶肉汤(Moeller)5.9 MR-VP肉汤中华人民共和国国家质量监督检验检霞总局2001-12-30批准2002 - 06 -01实施5.10 ONPG脏水5. 11 Andrade氏糖类肉汤5.12 氧化酶试剂5.13 粘丝试验溶液5.14 革兰民染色液5.15 5%红细胞生理盐水5.16 50单位多粘菌素B纸片5.17 10g和15
5、0gO/129纸片SN /T 1022 - 2001 5.18 霍乱弧菌诊断血清(01群及0139群)注:培养基和试剂的配制见附录AC标准的附录)。6 检验步骤检验步骤见图l所示。KIA TSI AGS T1No TN3 (36士。K/、A/A K/a + 十18h24h 图1霍乱弧菌检验步骤图2 SN /T 1022 - 2001 6. 1 增菌称取检样25g，加入装有225mL碱性蛋白脏水增菌液(APW)的广口瓶内。固体样品应以均质器8 000 r/min10 000 r/min打碎，或以剪刀充分剪碎。(36:l:1) C培养6h8 h和16h24 h。如为牡蜘样品，应同样制备另一份检样，
6、置于APW中，42C培养6h8 h和16h24 h。6.2 分离以3mm5 mm接种环取6h8h和16h24 h增菌培养液的表面生长物一环分别划线接种TCBS琼脂平板至少各一个，于(36士1)oC培养18h24 ho 在TCBS琼脂上，典型的霍乱弧菌菌落为大的，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。6. 3 初步鉴定6. 3. 1 用接种环挑取TCBS琼脂平板上25个可疑菌落，划线于T)Nj琼脂土，(36:l:1)C培养12h 18 h。6.3.2 以无菌白色滤纸沾取TjN)琼脂表面培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。6. 3. 3 以接种环取氧化酶阳性的培养物于0.5%去氧胆酸铀
7、液滴中，进行粘丝试验。6. 3. 4 以接种针取氧化酶和粘丝试验阳性的培养物，接种TSI、KIA和AGS，穿剌底层并划线斜面。6. 3. 5 以接种针取上项相同培养物接种T)N。和TN3肉汤。6. 3. 6 将TSLKIA、AGS、T)N。和T)N3肉汤于(36士l)C培养18h24 ho 霍乱弧菌与相关细菌的鉴别见表1。表l霍乱弧菌与相关细菌在初步鉴定试验中的反应KIA TSI AGS 斜面底层斜面底层斜面底层霍乱弧菌K fdA A/ / A(K少见)A K a 拟态弧菌K K(A少见)A K A 副溶血性弧菌K A K A K A 溶藻性弧菌K A A A K A 创伤弧菌K或AA K(A
8、少见)A K A 嗜水气单胞菌K或AA k或AA K K 类志贺邻单胞茵K或AA K或lyA ND ND 严注:K碱性;A酸性;a一微酸性;ND一未鉴定。T1No T1N3 + + + + + + 十十十弧菌属细菌在TSI、KIA、AGS中不产硫化氢(H2S)，也不产气。一些气单胞菌属菌株可能产气。6.4 确认试验以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T)N3培养物，分别接种到以下培养基:Hugh-Leifson葡萄糖肉汤(HLGB)，(36:l: 1) C培养18h24 h。ONPG陈水，(36士1)C培养，1h3 h或24h。颇氨酸脱竣酶肉汤，(36:l:1)C培养24h96 h。阿拉伯
9、糖肉汤，(36士1)C培养24h。0/129试验用培养基，(36士1)C培养18h24 h。霍乱弧菌的生化反应见表2。3 SN /T 1022 - 2001 表2霍乱弧菌的生化性状生化项目生化性状生化项目生化性状TCBS Y D甘露醇十AGS Ka 氧化酶十NaCl 0,% + ONPG + 3,% 十v-p V 6 ,% 精氨酸双水解酶8,% 赖氨酸脱竣酶十10 ,% 鸟氨酸脱竣酶十42C生长十抑菌试验蕉糖10g 0/129 S D纤维二糖150g 0/129 S 乳糖明胶酶+ 阿拉伯糖尿素酶D一甘露糖十注:Y黄色:K碱性:a微酸性:+-80，%或更多的菌株阳性:-80，%或更多的菌株阴性:
10、V一依据种或菌株的可变反应:S敏感:AGS精氨酸葡萄糖斜面。所有试验均不产硫化氢和气体。7 血清学;提集试验7. 1 自分离培养基上挑取可疑菌落与01群及0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。7.2 01群多价血清阳性的霍乱弧菌可进一步用小川型、稻叶型的单价抗血清分型。7.2.1 在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。7.2.2 在小川型单价血清不凝集，在稻叶型单价血清凝集者为稻叶型。7.2.3 在小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。7.3 与01群或0139群霍乱
11、弧菌诊断血清及生理盐水均不凝集者为非01群霍乱弧菌。7- 4 与01群霍乱弧菌多价血清或0139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均凝集的，可用膜陈水大豆琼脂或脑心浸液琼脂传代，再进行凝集试验。7.5 对玻片凝集反应不典型的菌株应做试管凝集试验。用生理盐水自1: 20开始对倍连续稀释。1群霍乱弧菌多价血清，每管含稀释血清0.5mLo将被检菌在营养琼脂的16h18 h培养物用0.2%甲醒生理盐水制成每毫升约含18亿菌体(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加入0.5mL;另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水中作为对照。摇匀，置37C3 h观察初步结果。再放4C或室温过夜，观察最后结果。
12、生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为十+;能使试验菌出现+凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度。凝集滴度达到或超过血清原效价一半即确定为01群霍乱弧菌。8 古典型与埃尔托型霍乱弧菌的鉴别8. 1 多粘菌素B敏感试验8. 1. 1 在膜醋陈大豆陈琼脂平板背面用玻璃笔划出若干方格。8.1.2 将被检菌(36:l:l)C4h肉汤培养物划线平板表面，待干后慑取50单位多粘菌素B纸片置于接种区中央，倒置平板，(36士1)C培养过夜。古典型菌株在纸片周围呈现抑制带(10mm15 mm直径)，而埃尔托型菌株不受抑制或轻微抑制(7 mm直径)。4 SN /T 1022 - 2001
13、8. 2 溶血试验8.2.1 将24h肉汤培养物和5%红细胞盐水悬液等量混合(0.5mL或1mL)。8. 2. 2 将上项部分混合液在56C加热30min做对照。8. 2. 3 将混合物在(36士1)C水浴中培养2h，再在C45)C下冷藏过夜。8.2.4 检查溶血现象。必要时可低速离心后再检查有元榕血现象。多数埃尔托型菌株会造成红血球溶解。古典型及某些埃尔托型菌株不溶解红血球。由于洛血素不耐热，加过热的培养物不会产生榕血。8. 3 加试剂观察结果。埃尔托型v-P试验8. 3. 1 接种MR-VP肉汤，22C培养18h24 h。8. 3. 2 滴菌株通常为阳性，古典型菌株为阴性。9 报告结果霍乱
14、弧菌的检出，可依据以下性状报告:革兰氏染色阴性，无芽胞或弯曲杆菌;TSI:斜面产酸/底层产酸，不产气，不产硫化氢CH2S); Hugh-Leifson试验:葡萄糖发酵阳性;氧化酶:阳性;精氨酸脱竣酶试验:阴性;赖氨酸脱竣酶试验:阳性;v-P试验:埃尔托生物型阳性，古典生物型阴性;42C生长:阳性;嗜盐性试验:O%NaCl十(有的非01群霍乱弧菌不生长)3%NaCl+ 煎糖发酵:阳性;ONPG试验:阳性;阿拉伯糖发酵:阴性;0/129抑菌试验:10月敏感;150g敏感;6%NaCl一血清学试验:01群(稻叶型、小)11型、彦岛型)、0139群、非01群。最终结果的报告，应在生化试验的基础上报告血
15、清群别、血清型别和生物型别。如有明确规定，仅需检验。1、0139群霍乱弧菌时，可直接对可疑菌株进行血清学凝集试验进行初步鉴定。检出01、0139及非01群霍乱弧菌的，要在24h内呈报到上一级实验室做进一步鉴定或复查，并报告国家出入境检验检疫局。5 A1 耐性蛋白陈水(APW)蛋白陈氧化铀10.0 g 10.0 g SN /T 1022 - 2001 附录A(标准的附录)培养基和试剂的配制蒸馆水1 000 mL 混匀后，调节pH值至(8.5:!:0. 2)，分装225mL于250mL广口瓶中，121C高压灭菌10min 。A2 TCBS琼脂酵母漫膏5.0 g 蛋白陈10.0 g 庶糖20.0 g
16、 硫代硫酸铀.5HzO10.0 g 拧攘酸铀.2HzO10.0 g 牛胆酸铀3.0 g 牛胆汁5.0 g 氧化饷10.0 g 拧朦酸铁1.0 g 1臭扉香草酣蓝0.04 g 爵香草酣蓝0.04 g 琼脂1.8.0 g 蒸馆水1 000 mL 除指示剂外，将各成分加热榕解，调至pH8.6，加入指示剂。此培养基不必高压灭菌，煮沸1min 2 mi丑，分装20mL于15mmX100 mm平皿内。A3 三糖铁琼脂(TSI)牛肉浸膏蛋白陈乳糖庶糖葡萄糖3.0 g 20.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g 硫酸亚铁0.5 g 氧化铀30.0 g 琼脂12.0 g 酣红0.024 g 除琼脂和酣
17、红外，将其他成分用蒸馆水400mL微火加热搭解，同时将琼脂置于600mL蒸锢水中，浸泡数分钟后，加热煮沸使完全溶解。然后将以上两液混合均匀。调整pH7.4后，加入指示剂混合均匀，分装于15mmX150 mm试管，每管盛3mL4 mL，1l5C高压灭菌15min。灭菌后摆成斜面，使高层和斜面各约3cm。SN /T 1022 - 2001 A4 现糖铁琼脂(KIA)牛肉、浸膏3.0 g 酵母浸膏3.0 g 际蛋白陈15.0 g 蛋白陈5.0 g 乳糖5.0 g 葡萄糖1.0 g 硫酸亚铁0.2 g 氧化铀20.0 g 硫代硫酸铀0.3 g 琼脂12.0 g 酣红0.024 g 蒸悟水1 0.0 0
18、 mL 将各成分加入蒸悟水中，充分混匀，搅拌加热，煮沸约1min。最终pHC7.4:l:2)。分装13mmX 100 mm试管，121cC高压灭菌15mino高压后制成高层斜面备用。A5 T1N1胃、脂膜陈10.0 g 氯化铀10.0 g 琼脂20.gg 蒸t留水1 000 mL 将各成分加入蒸馆水中，充分混匀，搅拌加热直至煮沸。121C高压灭菌15min。最终pHC7.2:l:0.2)。倾注平板备用。在上咦成分中改变氯化铀的含量(TjNo:不加氯化铀，T1N3:氯化铀为30.0g)，去除琼脂可制成TN。和TN3肉汤。:A6 精氨酸葡萄糖斜面琼脂(AGS)蛋白陈5.0 g 酵母浸膏3.0 g
19、膜陈10.0、g氯化铀20.0 gc 葡萄糖1.0 g 精氨酸5.0 g 拧攘酸铁胶0.5 g 硫代硫酸饷0.3 g 澳甲酣紫0.02 g 琼脂13.5 g 蒸悟水1 000 mL 将各成分加入蒸馆水中，充分混匀，搅忏加热至煮沸约1mino最终pH(6.87. 0)。分装13mmX 100 mm试管，121C高压灭菌15min，高压后制成高层斜面备用。7 SN /T 1022 - 2001 A7 Hugh-Leifon葡萄糖肉汤(HLGB)蛋白陈2.0 g 酵母浸膏0.5 g 氯化铀30.0 g 葡萄糖10.0 g 澳甲酣紫0.015 g 琼脂3.0 g 蒸馆水1 000 mL 将各成分(除1
20、臭甲酣紫外)加入蒸馆水中，充分?昆匀，搅拌加热溶解调节pH7.4，加入澳甲酣紫，混匀，分装于15mmX150 mm试管的二分之一容量，121C高压灭菌15min。接种后覆盖约1mL灭菌矿物油以检查葡萄糖发酵。A8 赖氨酸脱搂酶肉汤(Moeller)蛋白陈5.0 g 牛肉浸膏5.0 g 葡萄糖0.5 g 澳甲酣紫0.01 g 甲酣红0.005 g 口比哆醒0.005 g 蒸馆水1 000 mL 将各成分加入蒸悟水中，轻轻搅拌加热至溶解。溶解L-赖氨酸10.0g。分装3mL于13mmX 100 mm 试管中。另以不加氨基酸的基础液作试验对照。121cC灭菌10min。接种后覆盖约1mL矿物油。最终
21、pHC6.O:!:O. 2)。A9 MR-VP肉汤际陈葡萄糖磷酸氢二押蒸馆水7.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000 mL 将各成分榕解于800mL蒸锢水中，微热过滤，冷却至20C，稀释到1000 mL 121 cC高压灭菌12 min15 min。最终pHC6.9:!:0. 2)。A10 ONPG脏水1%蛋白脏水CpH7.5)300.0 mL ONPG溶液100.0 mL 称取磷硝基酣日-D半乳糖昔0.6g榕于0.01mol/L磷酸氢二铀缓冲被100mL中，过滤除菌，加入300mL灭菌蛋白脏水中混匀，分装试管，每管约2mL3 mL。避光保存，如变黄应弃去。接种后培养液变黄为阳性。A 1
22、1 Andrade氏糖类肉汤和指示荆基础液:牛肉浸膏3.0 g 8 蛋白蹄;氧化铀10.0 g 10.0 g SN /T 1022 - 2001 蒸锢水1 000 mL 调节pH值(7.2土0.2)。在121C高压灭菌15mino Andrade氏指示剂:酸性品红蒸馆水0.2 g 100.0 mL 1 mol/L氢氧化铀16.0 mL 使用前要脱色。如果需要加1mL2 mL氢氧化铀梅液。加10mL指示剂到1L基础液中。糖储备液:用葡萄糖、乳糖、萧糖和甘糖配制10%搭液。用卫矛醇、水杨素和其他糖类配制5%溶液。通过O. 20m滤膜过捷、除菌。用基础液按1: 10稀释糖溶液，加Andrade氏指示
23、剂至所需浓度，泪合。A12 氧化酶试剂海解1.0g二盐酸四甲基对苯二胶于盛有100mL水的暗色玻璃瓶中，冰箱内存放7天以内，勿需高压灭菌。阳性培养物在1min内产生黑紫色斑点。A 13 粘丝试验溶液溶解0.5g去氧胆酸铀于100mL水中，拧紧瓶盖保存于冰箱中。勿需高压灭菌。霍乱弧菌在该榕液中被乳化后，1min内形成粘液样团块。当粘块从玻片上被拉出2cm3 cm日才成粘丝。9 OONNNCHZ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中霍乱弧菌检验方法SN/T 1022-2001 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷英印张1字数19千字2002年5月第一次印刷开本880X12301/16 2002年5月第一版印数12 000 定价10.00元* 书号:155066 2-14395 网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1022-2001
