1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1022-2010 代替SN/T1022-2001 进出口食品中霍乱弧菌检验方法Detection of Vibrio cholerae in food for import and export 2010-01-10发布2010-07-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 1022-2010 目。吕本标准代替SN/T1022-2001(出口食品中霍乱弧菌检验方法。本标准参照ISO/TS21872-1:2007(食品和饲料的微生物学检验方法致病性弧菌属的水平检验方法第一部分:副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检验CMicrobiolog
2、y of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. - Part 1: Detection of Vibrioarahaemolyticus and Vibrio cholerae)、NMKL-methodNo. 156 , 2nd ed. 1997(致病性弧菌属食品中的检测与计数CPathogenicVibrio species. Detection and enumeration in foodsH，对原标准文本
3、格式、文字表述和文本内容进行修订。本标准与SN/T1022-2001相比，主要变化如下:-一一将原标准名称修订为进出口食品中霍乱弧菌检验方法; 一一将原标准的范围进行了修订;一一将抽样修订为样品保存与制备。在3.2试样制备中增加了不同类型样品的制备方法。在3.3试样保存中增加了样品的保存方法;增加了方法提要;培养基、试剂的配方参照ISO/TS21872-1方法进行了部分修订;对原标准的检测步骤进行了修订，由同一增菌液中两次增菌的方法修订为两次选择性增菌方法。并针对加工产品，如加热、冷冻、烘干或者盐渍样品，选择37C进行第一次增菌培养，新鲜样品41.5 C进行第一次增菌培养;一一一增加了显色培养
4、基进行筛选检测。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局。本标准主要起草人:徐君怡、曹际娟、王刚、雷质文、郑秋月，、杨春华、徐杨、赵昕、齐震玉、刘淑艳。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:SN/T 1022-2001。I SNjT 1022-2010 进出口食品中霍乱弧菌检验方法1 范围本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的检验方法。本标准适用于食品中霍乱弧菌的检验，动物饲料和其他食品生产和加工区域环境样品中的霍乱弧菌检验
5、可参照使用。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN 0330 出口食品中微生物学检验通则SN/T 1538.1 培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则SN/T 1538.2 培养基制备指南第2部分:培养基性能测试实用指南3 样晶保存与制备3. 1 取样取样数量及取样方法按SN0330进行。3.2 试样制备3.2. 1 普通样晶从混合样品中取出代表
6、性样品，将可食部分(带壳贝类按3.2.2方法去除贝壳)充分混匀。用四分法缩分出不小于500g作为试样，装入灭菌容器内，加封标识。3.2.2 带壳贝类应先在清洁的流水中洗净外壳，用70%的乙醇消毒，然后以元菌操作切断闭壳肌，打开贝壳。取出含内脏的全部贝肉和贝液。每个检测样品至少应包括6个贝类个体。3.3 试样保存样品采集后应立即在70C100C保存.24h内检验。如果样品需要冷冻，于一18oC保存.24h内检验。为了最大限度地保证弧菌的存活率，应避免样品与冰直接接触。4 设备和材料4. 1 均质器:8000 r/min10 000 r/min。4.2 恒温培养箱:37 oC :l: 1 oC。4
7、.3 恒温培养箱或恒温水浴锅:41.5 oC土1oC。4.4 恒温水浴锅:37oC士1oC。4.5 显微镜。5 培养基和试剂5. 1 碱性蛋白陈水(APW).见附录A第A.1章。5.2 TCBS琼脂，见附录A第A.2章。5. 3 CHROM ID VIBRIO弧菌显色培养基，见附录A第A.3章。l SN/T 1022-2010 5.4 氧化铀营养琼脂，见附录A第A.4章。5.5 氯化纳三糖铁琼脂，见附录A第A.5章。5.6 氧化酶试剂，见附录A第A.6章。5. 7 鸟氨酸脱竣酶氯化饷肉汤(ODC)，见附录A第A.7章。5.8 赖氨酸脱竣酶氯化铀肉汤(LDC)，见附录A第A.8.章。5.9 精氨
8、酸双水解酶氯化铀肉汤(ADH)，见附录A第A.9章。5.10 半乳糖昔酶试剂，见附录A第A.10章。5. 11 能基质氯化铀肉汤，见附录A第A.11章。5. 12 氯化饷蛋白陈水，见附录A第A.12章。5. 13 1 %氯化铀溶液，见附录A5.14 5%红细胞生理盐水。5.15 多粘菌素B纸片:50单位。5. 16 0/129纸片:10g和150g。5. 17 霍乱弧菌诊断血清(01群及0139群)。6 方法提要与流程6. 1 通则霍乱弧茵通常在样品中数为保证检出目标菌，应进行两6.2 液体选择性培养基中第一室温下，用待检样品接种碱性蛋白陈1 oc培养6h:!:l h。对于新鲜样品6.3 液体
9、选择牲培养基中第二次用6.2中的培养物接种碱性6.4 分离和鉴定将6.2和6.3的培养物接纯化的菌落，进而进行生化鉴定。6.5 检测流程食品中霍乱弧菌检测流程参7 检测步骤7. 1 第一次选择性增菌细菌或者其他种属的微生物。样品、干品和盐渍样品，在37oC:!: 培养18h:!: 1 h。菌显色培养基平板以获得分离以元菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌APW增菌液的均质杯内，于8000 r/min 10 000 r/min均质1min2 min，或J.V，剪刀充分剪碎，制成1:.10样品匀液。深冻样品、干品、盐渍产品的初始增菌液放置在37oc士1oc培养6h:!: 1 h，新鲜样品的
10、初始增菌液放置在41.5 oc土1oc培养6h:!:lh。如果样品不够25g，则取全部样品，加入9xmL增菌液以获得10-1浓度的样品匀液。如果上述制备的待检样品不能够在当日进行培养，应放置在2oC8 oC保存至次日。注:加入样品前，APW应预先保温至370C士1oC。7.2 第二次选择性增菌从7.1取1mL培养物接种到10mL的APW中，置于41.5 oC:!: 1 oC培养18h:!: 1 h。7.3 分离7.3. 1 分别用直径为3mm的接种环从7.1和7.2的APW增菌液中蘸取一接种环，划线接种TCBS琼脂和CHROMID VIBRIO弧菌显色培养基平板以分离菌落。7.3.2 在37o
11、C :l: 1 oC培养箱中，将平板倒置培养。SN/T 1022-2010 7.3.3 经过24h士3h培养后，检查平板有无可疑菌落。在平板的背面标记可疑菌落。霍乱弧菌在TCBS上的可疑菌落形态为:表面光滑，黄色，直径约为2mm3 mm。霍乱弧菌在CHROMID VIB RIO弧菌显色培养基上的可疑菌落形态为:蓝色，蓝绿色到绿色菌落(某些弧菌如创伤弧菌及梅氏弧菌可能会产生与霍乱弧菌相似的蓝色到蓝绿色菌落)。7.4 鉴定7.4.1 选择可疑菌落并纯化菌落至少应挑取5个可疑菌落，进行传代培养。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取传代培养。注:食品，特别是海产品，可能含有段选择的菌落太少，则
12、可造成在氯化铀营养琼脂平板或试1 oc培养箱中培养24h士3h。对氯化饷营养琼脂上的纯培养物进行7.4.2 初步鉴定7.4.2. 1 显微镜下检验a) 革兰氏染色试验:霍乱弧b) 动力试验:将可疑菌落的载玻片上，盖上盖玻7.4.2.2 氧化酶试验以无菌白色滤纸蘸取营养琼脂10 s内变为紫色或者深紫色，则为7.4.2.3 氯化纳三糖铁试验接种氯化铀兰糖铁斜面，穿反应结果解释如下:a) 琼脂底层1) 黄色:葡萄糖发酵2) 红色或者未变色:3) 黑色:产生硫化氢;的产生气泡或者培养基b) 琼脂斜面1) 黄色:乳糖或-m;糖阳性(利用乳糖或蔚糖); 择性培养阶段生长。若在传代培养阶养以获得纯培养物。在
13、37oC :l: 弯曲状;h6h。滴一滴菌悬液于一干净养物应为运动性阳性。进行氧化酶试验。如果滤纸颜色在中培养24h士3h。2) 红色或未变色:乳糖或震糖阴性(不利用乳糖或蔚糖); 3) 可疑的霍乱弧菌在氯化纳三糖铁斜面上的反应为底层黄色，斜面黄色，不产生硫化氢，不产气。培养应不超过24h(斜面的黄色可能在24h后变为红色)。7.4.2.4 生化测试菌株选择选择革兰民染色阴性，运动性阳性，氧化酶阳性，氧化铀三糖铁试验符合霍乱弧菌特性的菌落在氯化纳营养琼脂平板或试管斜面纯化后，按7.4.3进行生化确认，或采用法国梅里埃公司的ID32E鉴定试剂条进行生化鉴定(按该试剂盒的操作说明进行)。7.4.3
14、 生化确认7.4.3. 1 鸟氨酸脱援酶试验接种鸟氨酸脱殷酶氯化铀肉汤(5.7)，在肉汤上面覆盖1mL灭菌矿物油。37oC :l: 1 oC培养24h土3h。培养后液体混浊变紫为阳性反应(细菌生长，鸟氨酸脱竣)。液体黄色为阴性反应。3 SN/T 1022-2010 7.4.3.2 赖氨酸脱搂酶试验接种赖氨酸脱竣酶氯化铀肉汤(5.8)，在肉汤上面覆盖1mL灭菌矿物油。37oC :l: 1 oC培养24h士3h。培养后液体混浊变紫为阳性反应(细菌生长，赖氨酸脱竣)。液体黄色为阴性反应。7.4.3.3 精氨酸双水解酶试验接种精氨酸双水解酶氯化铀肉汤(5.9)，在肉汤上面覆盖1mL灭菌矿物油。37oC
15、 :l: 1 oC培养24h:l: 3 ho 培养后液体混浊变紫为阳性反应(细菌生长，精氨酸双水解)。液体黄色为阴性反应。7.4.3.4 萨半乳糖苦酶试验挑取可疑菌落，在装有0.25mL氯化锅溶液(5.13)的试管中制成菌悬液，加入一滴甲苯，振摇试管。将试管放入37oC :l: 1 oC水浴锅中，静置5min。再加入0.25mL -半乳糖昔酶试剂(5.10)，混匀。将试管放入37oC :l: 1 oC水浴锅中，放置24h士3h，随时观察。培养后液体变黄为阳性反应(存在R半乳糖昔酶)。反应结果通常20min后可见。24h后元颜色变化为阴性反应。7.4.3.5 髓基质试验将可疑菌落接种于装有5mL
16、膜蛋白陈色氨酸氯化铀肉汤(5.11)中。37oC :l: 1 oC培养24h :l: 3 h。培养后加入1mL Kovacs试剂。形成红色环为阳性反应(形成蚓噪)，黄色环为阴性反应。7.4.3.6 氯化铀耐受试验准备一系列浓度的氯化纳蛋白陈水(5.12)，氧化铀浓度依次为:0%、2%、4%、6%、8%和10%。用待鉴定菌落的菌悬液接种每个试管。37oC士1oC培养24h :l: 3 h。观察试管中液体变混浊可知细菌能在相应的氯化铀浓度下生长。7.4.3.7 0/129敏感试验将0/129(2，4二氨基6，7二异丙基喋脏)为10问及150阔的药敏纸片贴在接种有待测菌的氧化铀营养琼脂平板，37oC
17、士1oC 18 h24 h孵育后，纸片周围任何大小的抑菌环均表现为敏感。霍乱弧菌的生化性状见表1。表1霍乱弧菌的生化性状生化项目生化性状生化项目生化性状氧化酶+ 能基质+ 产气(葡萄糖)蛋白陈水中生长乳糖0%氯化纳十煎糖十2%氯化锅+ 鸟氨酸脱竣酶(DC)+ 6%氯化纳赖氨酸脱竣酶(LDC)+ 8%氯化纳10%氯化纳精氨酸双水解酶(ADH)D-纤维二糖抑菌实验D-甘露糖十10g 0/129 S 阿拉伯糖150g 0/129 S ONPG水解十明胶酶+ 42 C生长十尿素酶注1:十表示76%89%或更多的菌株阳性;S表示敏感。注2:培养基中含有1%氯化锅。注3:所有实验均不产硫化氢和气体。注4:
18、有的非01群霍乱弧菌0%氯化纳不生长。4 SN/T 1022-2010 7.5 血清学凝集试验7.5.1 血清分群试验自分离培养基上挑取可疑菌落与01群及0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为01群或0139群阳性。与01或0139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均不凝集，且生化反应符合霍乱弧菌特性的为非01群霍乱弧菌。与01群霍乱弧菌多价血清或0139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均凝集的，可用膜陈水大豆琼脂或脑心浸液琼脂传代，再进行凝集试验。7.5.2 血清分型试验与01群多价血清阳性的霍乱弧菌可进一
19、步用小川型、稻叶型的单价抗血清分型:a) 与小川型单价血清凝集，但与稻叶型单价血清不凝集者为小川型;b) 与小川型单价血清不凝集，但与稻叶型单价血清凝集者为稻叶型;c) 与小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。7.5.3 试管凝集试验对玻片凝集反应不典型的菌株应做试管凝集试验。用生理盐水自1: 20开始对倍连续稀释01群霍乱弧菌多价血清，每管含稀释血清0.5mL。将被检菌在营养琼脂的16h18 h培养物用0.2%甲醒生理盐水制成每毫升约含1.8 x 109CFU(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加入0.5 mL;另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水中作为对照。摇匀，
20、置37oc士1oc培养3h观察初步结果。再放4oc或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为+十;能使试验菌出现+凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度。凝集滴度达到或超过血清原效价一半即确定为01群霍乱弧菌。7.6 01群霍乱弧菌生物分型试验7.6. 1 多粘菌素B敏感试验在膜酷陈大豆陈琼脂平板背面用玻璃笔划出若干方格。将37oc士1oC 4 h的被检菌肉汤培养物划线平板表面，待干后慑取50单位多粘菌素B纸片(直径6mm)置于接种区中央，倒置平板.37oC士1 oC培养过夜。古典型菌株在纸片周围呈现抑制带(10mm15 mm直径).而埃尔托型菌株不
21、受抑制或轻微抑制(6 mm7 mm直径)。7.6.2 溶血试验将24h肉汤培养物和5%红细胞盐水悬液等量混合(0.5mL或1mL)。取部分混合液在56oC加热30min做对照。另将混合物在37oC士1oC水洛中培养2h.再在40C50C下冷藏过夜。检查溶血现象。必要时可低速离心后再检查有无搭血现象。多数埃尔托型菌株会造成红血球榕解。古典型及某些埃尔托型菌株不溶解红血球。因榕血素不耐热，加过热的培养物不会产生溶血。7.6.3 v-p试验接种MR-VP肉2药.22oC培.养18h24 h。古典型菌株为阴性。多数埃尔托型菌株为阳性或有少数阴性。1111仙州川川rillfjii lIlk-11鹏相配f
22、f但他腼EWl吁吁f刊ltluv报告结果根据上述试验结果，表明在xg或者xmL样品中检出或未检出霍乱弧菌。最终结果可进一步报告血清群别、血清型别和生物型别。检出01，0139及非01群霍乱弧菌的，要在24h内呈报到上一级实验室做进一步鉴定或复查，并报告相关部门。5 8 SN/T 1022-2010 A.1 耐性蛋白陈水A. 1. 1 组成蛋白陈氯化铀蒸馆水A. 1.2 制法15 min。A.2 TCBS琼脂A.2.1 组成蛋白陈酵母浸膏拧攘酸铀硫代硫酸铀拧攘酸铁氯化铀牛胆盐蘸糖靡香草酣蓝澳靡香草酣蓝琼脂水A.2.2 制法附录A(规范性附录)培养基和试剂1)20.0 g 口瓶或者试管中，121o
23、c灭菌将各成分加热煮沸，调节pH至8.6士0.2(250C)。不要高压灭菌。分装15mL20 mL于培养皿内制成平板。A. 3 CHROM ID VIBRIO弧菌显色培养基2)A. 3.1 组成蛋白陈(牛)肉浸膏(牛或猪)大豆蛋白陈氯化铀16.5 g 0.5 g 5 g 6 g 1) 为保证培养基的质量，应按SN/T1538. 1、SN/T1538.2进行培养基的制备与性能测试。若使用商售的脱水合成培养基，应选用国内外通过1SO9000质量管理体系认证生产厂商的产品并按其说明制备和使用。2) 该培养基为法国梅里埃公司的产品。6 k A. 4.1 组成牛肉浸膏蛋白陈氯化铀琼脂水A.4.2 司司法
24、?昆匀后，调节pH至灭菌后为7.2:l:皿内制成平板。或者分装10mL于aSN/T 1022一2010。分装15mL20 mL于培养皿0.85 g 0.01 g 16.6 g 0.6 g O. 125 g 0.033 g llg 1 000 mL 碳酸铀中性红碳水化合物混合物胆盐(牛或绵羊)显色剂混合物选择性?昆合物琼脂纯水A.3.2 制法将各成分加热煮沸，调节pH内制成平板。氯化铀营养琼脂A.4 l蝇5 min。分装15mL20 mL于培养A. 5.1 组成蛋白陈牛肉浸膏酵母浸膏氯化铀乳糖蘑糖拧攘酸铁酣红琼脂水A.5.2 制法混匀后，调节pH至灭菌后为7.4:l: 0. 2(25 OC)。分
25、装10mL于试管中，121oc灭菌15min。倾斜放置，制成斜面。氯化铀三糖铁琼脂A.5 四JHH!7 1. 0g 100 mL 氧化酶试剂A. 6.1 组成四甲基间苯二胶水A.6 JWHtrhittmm如fuwjvSN/T 1022一2010A. 6. 2 制法使用前在冷水中溶解。A.7 鸟氨酸脱捶酶氯化铀肉汤(ODC)A. 7.1 组成L-鸟氨酸酵母浸膏葡萄糖澳甲酣紫氯化铀水A.7.2 制法5.0 g 3.0 g 1. 0g 0.015 g 10.0 g 1 000 mL 混匀后，调节pH至6.8:f: 0. 2(25 oC)。分装2mL5 mL于小试管中，121oC灭菌15min A.8
26、 赖氨酸脱搓酶氯化铀肉汤(LDC)A. 8.1 组成L赖氨酸酵母浸膏葡萄糖澳甲酣紫氯化铀水A.8.2 制法5.0 g 3.0 g 1. 0g 0.015 g 10.0 g 1 000 mL 混匀后，调节pH至6.8:f: 0. 2(25 oC)。分装2mL5 mL于小试管中，121oC灭菌15mino A.9 精氨酸双水解酶氧化铀肉汤(ADH)A. 9.1 组成精氨酸酵母浸膏葡萄糖澳甲酣紫氯化纳水A.9.2 制法5.0 g 3.0 g 1. 0g 0.015 g 10.0 g 1 000 mL 混匀后，调节pH至6.8士0.2(25oC)。分装2mL5 mL于小试管中，121oC灭菌15min
27、o A.10 p-半乳糖苦酶试剂A. 10. 1 ONPG溶液A. 10. 1. 1 组成8 磷硝基酣R半乳糖昔水0.08 g 15 mL hl A. 10. 1.2 制法将ONPG榕于50.C水中。将榕掖冷却。A. 10.2 缓冲液A.10.2.1 组成磷酸二氢饷(NaH2P04) 氢氧化铀(NaOH)(0.1 mol/L) 水，补足至A.10.2.2 制法SN/T 1022-2010 6.9 g 3 mL 50 mL 50 mL容量瓶中将磷酸二氢纳(NaH2P04)溶于约45mL水中，用0.1mol/L的氢氧化铀溶液调节pH至7.O:J: O. 2(25 .C)，用水补足体积至50mL。A
28、. 10.3 试验用混合试剂A. 10.3. 1 组成缓冲液(A.10. 2) ONPG潜液(A.10. 1) A.10.3.2 制法5 mL 15 mL 将缓冲液加入ONPG榕液中。在o.C5 .C保存。A.11 髓基质氧化铀肉汤A. 11. 1 色氨酸氯化铀肉汤A.1 1. 1.1 组成酷蛋白陈(酶消化)DL-色氨酸氯化铀水A. 11. 1.2 制法10.0 g 1. 0g 10.0 g 1 000 mL ?昆匀，过滤。调节pH至灭菌后为7.O:J: O. 2(25 .C)。分装5mL于试管中，121.C灭菌15mino A. 11. 2 Kovacs试荆A. 11. 2. 1 组成对二甲
29、胶基苯甲醒盐酸(p=1.18 g/mL1. 19 g/mL) 2甲基-2-丁醇A. 11. 2. 2 制法将3种物质1昆匀。A.12 氯化制蛋白脏水5 g 25 mL 75 mL 10 g A. 12. 1 组成蛋白陈氯化纳水0，20，60，80或100g 1 000 mL A. 12.2 制法?昆匀后，调节pH至灭菌后为7.5士0.2(25.C)。分装10mL于试管中，121.C灭菌15min。9 SN/T 1022-2010 A.13 1 %氯化制溶液A. 13. 1 组成氯化铀水A. 13.2 制法10.0 g 1 000 mL 混匀后，调节pH至灭菌后为7.5:l: 0. 2(25 O
30、C)。分装10mL于试管中，121oc灭菌15min。10 SN/T 1022-2010 附录(资料性附录)进出口食品中霍乱弧菌检测流程图B 25 g(或x检样加入225mL(或9xmL)的APW中第一次增菌培养6h士1h 新鲜样品在41.5 .C :t1 .C培养TCBS琼脂平板和弧菌显色平板上分离培养，37.C, 24h:!:3h 氯化纳营养琼脂，37.C培养24h:!:3 h -aitKILlv-FLLrdLii 血清学试验。1群、0137群或非01群01群z小JII、稻叶、彦岛型进出口食品中霍乱弧菌检测流程图固B.lli .F. OFON-NNOFv同Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中霍乱弧菌检验方法SN/T 1022-2010 9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷奇峰开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2010年4月第一版2010年4月第一次印刷印数1-1600 , 定价18.00元9峰书号:155066 2-20676 SN/T 1022-2010
