1、 ICS 65.020.99 CCS B 05 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 43812026 低温耐盐碱玉米秸秆高效降解菌 筛选技术规程 Code of practice for screening of low temperature saline-alkali tolerance corn straw highly effective degradation microorganism 2026-04-30 发布2026-05-30 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 43812026 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准
2、化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：于晓芳、高聚林、赵晓宇、青格尔、马达灵、李瑞平、屈佳伟、胡树平、孙继颖、李懿璞、刘剑、塔娜、王召、窦旭。DB15/T 43812026 1 低温耐盐碱玉米秸秆高效降解菌筛选技术规程 1 范围 本文件规定了低温耐盐碱高效玉米秸秆降解微生物的培养基配制、初筛、分离纯化、复筛及菌株保存等技术要求。本文件适用于秸秆降解菌的研发与生产单位筛选低温耐盐碱玉米秸秆高效降解菌株。2 规范性引用文件 下列
3、文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 23874 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 GB/T 35808 林业生物质原料分析方法 纤维素酶活性测定 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。耐冷微生物 psychrotolerant microorganism 最适生长温度低于 25，能在 0 5 生长繁殖的微生物，又称耐冷菌。耐盐微生物 saline-tolerant microorg
4、anism 通在低盐条件下良好生长，在高盐性环境下也能正常生长繁殖的微生物。耐碱微生物 alkali-tolerant microorganism 在中性及酸性条件下良好生长，但在高碱性环境下也能正常生长繁殖的微生物。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。ABTS：2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid)DB15/T 43812026 2 CMC：羧甲基纤维素（Carboxymethyl Cellulose）XYL：木聚糖酶（Xylanase）LIP：木质素过氧化物酶（Lignin
5、Peroxidase）MNP：锰过氧化物酶（Mn-Dependent Peroxidase）LAC：漆酶（Laccase）5 样品采集 在盐碱地采用 5 点取样法，采集深度为 25 cm30 cm 的土样，混匀、密封、避光，置于冰箱 4 条件下冷藏，7 d 内待用。6 筛选流程 初筛 6.1.1 土壤浸提液制备 称取10 g土样，装入100 mL三角瓶中，加入90 mL蒸馏水，放置在摇床中摇匀，转速为160 r/min，时间为30 min，静置待土壤沉淀，滤纸过滤，收集上清液，配置梯度浓度（10-110-9）的土壤浸提液。6.1.2 培养基制备 所用培养基配方及相关仪器设备见附录A。6.1.3
6、 菌株初筛 无菌条件下，分别选取不同浓度的土壤浸提液100 L，涂布于羧甲基纤维素培养基和碱性木质素培养基两种选择培养基上，10 培养7 d。观察记录菌落形态和颜色，标选耐冷微生物、耐盐微生物、耐碱微生物，去除重复菌落。分离纯化 无菌条件下，选择特异性菌落，在LB培养基和改良马丁培养基上分离纯化，在25 培养1 d7 d，每天观察记录菌落生长情况，挑取不同形态单菌落在新的LB/马丁培养基上分离纯化，直至获得纯菌株为止。复筛 6.3.1 耐低温耐盐碱鉴定 无菌条件下，将纯化获得的单菌株制成浓度为1108 CFU/mL蒸馏水悬浮液，吸取100 L到LB/马丁培养基中，鉴定其低温和盐碱耐受性。将各菌
7、株分别放置在4 恒温摇床，转速120 r/min，培养7 d，选取OD6000.1的单菌株进行降解效率测定。6.3.2 降解效率测定 吸取筛选出的耐低温耐盐碱的单菌株100 L加入到玉米秸秆降解培养基中（见附录A），4 培养28 d，增设未接种菌的空白对照组，观察记录玉米秸秆降解情况，降解过程中每7天测定1次秸秆降解率，连续测定4次。筛选出秸秆降解率30%的菌株（按照附录B）。DB15/T 43812026 3 6.3.3 酶活性测定 对筛选到的耐低温耐盐碱高效秸秆降解菌株进行纤维素木质素酶活性测定（按照附录B）。降解菌酶活性筛选标准见表1。表1 玉米秸秆降解菌酶活性筛选标准 项目 数值范围
8、CMC 酶活性（U/L）85 Xyl 酶活性（U/L）70 Lip 酶活性（U/L）70 Mnp 酶活性（U/L）100 Lac 酶活性（U/L）90 7 菌种保存 甘油液保存法 将菌种与50%甘油按照1:2的体积比例混合后充分摇匀，-80 冰箱保存，具体按照SN/T 2632执行。液氮超低温保存法 将菌株悬液分装到冷冻管内，添加冷冻保护剂，液氮中冷冻保存，具体按照SN/T 2632执行。冷冻干燥保存法 将菌株悬液分装至安瓿瓶内，添加高压灭菌保护剂，冷冻干燥保存，具体按照 SN/T 2632 执行。DB15/T 43812026 4 A A 附录A （资料性）筛选低温耐盐碱玉米秸秆高效降解菌的
9、试验材料条件 A.1 仪器设备 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酸度计（精确值 0.01）、高压蒸汽灭菌锅、电子天平（精确值 0.001 g）、恒温干燥箱、离心机、磁力搅拌器(附加热功能)、恒温水浴锅、分光光度计、移液器（精度为 1 L）。A.2 培养基 A.2.1 LB培养基（筛选细菌）蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH6.07.0。120 灭菌 30 min。（若用固体培养基则加 20.0 g 琼脂）。A.2.2 改良马丁培养基（筛选真菌）蛋白胨 5.0 g，酵母浸出粉 2.0 g，葡萄糖 20.0 g，K2HPO4 1.0 g
10、MgSO47H2O 0.5g，蒸馏水 1000 mL，pH6.26.6。120 灭菌 30 min。（若用固体培养基则加 20.0 g 琼脂）。A.2.3 纤维素培养基(NH4)2SO4 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO47H2O 0.2 g，MnSO47H2O 0.01 g，CMC-Na 10 g，琼脂 15 g 20 g，pH7.0 左右，120 灭菌 30 min。A.2.4 木质素培养基(NH4)2SO4 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO47H2O 0.2 g，MnSO47H2O 0.01 g，lig 1
11、0 g，琼脂 15 g20 g，pH7.5 左右，120 灭菌 30 min。A.2.5 产酶培养基 尿素 0.6 g，蛋白胨 0.5 g，(NH3)2SO4 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO47H2O 0.05 g，MnSO47H2O 0.016 g，ZnSO47H2O 0.017 g，CaCl2 0.02 g，NaCl 0.2 g，蒸馏水 1000 mL，pH 自然，120 灭菌30 min。A.2.6 玉米秸秆降解培养基 玉米秸秆 2 g(1 cm2 cm 茎秆)，土壤浸提液 50 mL，NaCl 8%，0.1%酵母提取物或 0.05%蛋白胨，pH9，120 灭菌 30
12、min。DB15/T 43812026 5 B B 附录B （规范性）复配菌的降解效果测定方法 B.1 CMC 酶活性测定 按照GB/T 35808的规定执行。B.2 木聚糖酶活性测定 按照GB/T 23874的规定执行。B.3 木质素过氧化物酶活性测定 准确移取200 mM酒石酸缓冲液0.5 mL于容积为1.4 mL的比色皿中，加入40 mM藜芦醇0.1 mL。准确加入待测酶50 L、蒸馏水350 L。在30 条件下水浴10 min，加入浓度为20 mM过氧化氢溶液0.01 mL启动反应，使用分光光度计迅速测定310 nm处的吸光度，1 min后再测定1次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变
13、化（OD310变化），计算方法见公式B.1。U/L=OD310/9.31.01106/X（B.1）式中：U/L木质素过氧化物酶酶活单位；OD310测定310 nm处的吸光度，1 min后再测定1次，计算二者之差，单位为纳米（nm）;X待测酶液体积，单位为毫升（mL）。B.4 锰过氧化物酶活性测定 准确移取100 mM丙酸-丙二酸钠缓冲液0.5 mL于容积为1.4 mL的比色皿中，加入10 mM硫酸锰溶液0.1 mL。准确加入待测酶液50 L，加入蒸馏水350 L。在30 条件下水浴10 min，加入浓度为10 mM过氧化氢溶液0.01 mL启动反应，使用分光光度计迅速测定270 nm处的吸光度
14、1 min后再测定1次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（0D270变化），计算方法见公式B.2。U/L=OD270/11.5901.01106/X（B.2）式中：U/L锰过氧化物酶酶活单位；OD270测定270 nm处的吸光度，1 min后再测定1次，计算二者之差，单位为纳米（nm）;X待测酶液体积，单位为毫升（mL）。B.5 漆酶活性测定 准确移取100 mM丙二酸-丙二酸钠缓冲液（pH=4.5）和0.6 mM ABTS溶液各10 mL于试管中，混匀后放置于30 水浴30 min。取上述混合试剂1 mL于比色皿中，分光光度计420 nm处调零，准确吸取待测酶液50 L于加有混合试剂的
15、比色皿中，立即记录吸光值，每隔30 s记录1次，共3次，取平均值，折算成每分钟的吸光度变化（OD420变化），计算方法见公式B.3。U/L=OD420/36（1+X/1000）106/X（B.3）式中：U/L漆酶酶活单位；DB15/T 43812026 6 OD420测定420 nm处的吸光度，每隔30 s记录1次，共3次，取平均值，单位为纳米（nm）；X待测酶液体积，单位为毫升（mL）。B.6 秸秆降解率的测定 采用失重法，计算方法见公式B.4。D=（W0-W1）/W0100%（B.4）式中：D表示秸秆降解率，单位为百分比（%）；W0表示接种前培养基中的秸秆重，单位为克（g）；W1表示培养结束烘干后降解剩余物重，单位为克（g）。
