1、7,江苏省市场监督管理局发 布中 国 标 准 出 版 社出 版猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范Technical specifications of cellular immunoassays for porcine reproductive and respiratory syndrome virus20251030 发布20251130 实施CCS B 41ICS 11.DB32/T 52452025220DB32/T 52452025前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
2、本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省农业农村厅提出并组织实施。本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏立华食品集团股份有限公司、江苏省农业科学院、立华南京农业产业研究院有限公司。本文件主要起草人：张海涛、张雪寒、罗燕、李彬、张双玉、尹丽萍、丁小燕、赵永祥、孟宪臣、杨铜、汝晓飞、祁晓晓、汤子澈、郄博、常长琳、李昌明、武玮、韩宁宁、张泰康、许盛海。猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测DB32/T 52452025技术规范1范围本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒 MHC 肽四聚体细胞免疫检测技术的试剂及仪器、质量控制和结果判定，描述了相应的检测方法。本文件适用于
3、SLA1*040101 型猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测、疫苗免疫效力评价和病毒感染的早期诊断，其他基因型猪的相关检测方法可参照确立。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18090 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法GB 19489 实验室生物安全通用要求3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1主要组织相容性复合体major histocompatibility complex；MHC一组编码
4、动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。3.1.2SLA1 等位基因swine leukocyte antigen；SLA基因座上的不同形式的基因。注 1：SLA 是猪的 MHC。注 2：SLA1 是 SLA 系统中的一个基因座。3.1.3四聚体tetramer一种由四个 MHC 分子单体与一条抗原肽结合后，再与荧光标记物连接形成的多聚体蛋白复合物。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。APC：别藻蓝蛋白（Allophycocyanin）BirA：生物素连接酶（BiotinProtein Ligase A）CTL：细胞毒性 T 淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte）1DMSO：二
5、甲基亚砜（Dimethylslfoxide）FACS：流式细胞荧光分选技术（Florescence Activating Cell Sorter）FITC：异硫氰酸荧光素（Florescein Isothiocyanate Isomer）FSC：前向角散射光（Forward Scatter）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Bffered Saline）PRRS：猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reprodctive And Respiratory Syndrome）PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reprodctive And Respiratory Synd
6、rome Virs）PBMC：外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononclear Cell）RPE：藻红蛋白（RPhycoerythrin）SSC：侧向散射光（Side Scatter）TCR：T 细胞受体（T Cell ReceptorDB32/T 52452025）4主要器材4.1真空抗凝管。4.25 mL 或 10 mL 的无菌注射器。4.310 mL 或 15 mL 的透明无菌离心管。4.4一次性巴氏吸管。4.51 000 L 无菌长枪头。4.6可控温水平离心机。4.7流式细胞仪。4.8精密可调移液器，1 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L。
7、4.9流式管或 1.5 mL 离心管。4.10流式管管架或双面离心管架。4.11用于覆盖 1.5 mL 离心管板架或流式管的锡箔纸，避光用途。4.12冷藏展示柜。4.13细胞冻存管。4.14血细胞计数板。4.15倒置光学显微镜。5主要试剂5.1除另有规定外，所有试剂应为分析纯。5.2猪外周血单个核细胞分离液。5.3无菌 PBS 缓冲液，见附录 A 的 A.1。5.4细胞冻存液，见附录 B 的 B.5。5.5FACS 洗涤液，见 A.2。5.6无菌双蒸水。5.7流式抗体，见 A.3。5.8MHC 四聚体（PEpSLA+Tetramer，见附录 D）。5.9红细胞裂解液。26DB32/T 5245
8、2025检测6.1阴性样品制备见附录 B。6.2阳性样品制备见附录 C。6.3样品采集与处理6.3.1抗凝血采集，见 B.2。6.3.2PBMC 的分离见 B.3。6.3.3PBMC 的计数，B.5。6.3.4PBMC 的冻存，见 B.5。6.3.5SLA1 基因型检测方法，见附录 E。6.4样品染色6.4.1检测试剂配置：按照待检测样本数量，参照 A.3 配制染色液，含有 FITC mouse antipig CD3+、APC mouse antipig CD8a+和 PEpSLA+Tetramer 三种成份。6.4.2细胞染色：使用 6.4.1 配制的 FACS 染色混合液重悬细胞沉淀，2
9、00 L/样本，轻轻吹打混匀，4 8 避光孵育 30 min60 min。6.4.3细胞洗涤：将 6.4.2 孵育后细胞悬液，水平离心机，250 g 离心 10 min，取细胞沉淀，用 FACS 洗涤液清洗 2 次，再将细胞沉淀重悬于 FACS 洗涤液中，200 L/样本，应在 4 h 内上流式细胞仪分析。6.4.4若无法及时上机，可使用含有工作浓度为 1%2%多聚甲醛的 FACS 液体固定，4 8 避光保存，并在一周内尽快完成上机检测。6.5流式细胞术检测6.5.1设置仪器工作条件，包括环境温度、湿度、电源电压、大气压力、环境光照等。6.5.2开机后，对流式细胞仪进行清洗、光路系统进行校验，
10、应参照流式细胞仪的校验参数检测 FSC、SSC 和各荧光通道的平均荧光强度、变异系数和荧光分辨率。6.5.3应设置空白对照和单染管对照。6.5.4样本依次上样，应设置自动清洗、设定阈值和电压、进行荧光补偿。6.5.5与阴性样品对比，通过相应散点图中的荧光强度表达，区分出目标细胞的阳性信号并进行圈门。6.5.6 应在进样稳定后开始采集信号。有效细胞信号采集数量不低于 10 000 个细胞。信号采集时间不应超过 5 min。6.5.7数 据 分 析，使 用 高 版 本 号 软 件。根 据 FSC/SSC 双 参 数 获 得 单 核 淋 巴 细 胞 的 百 分 比，根 据FITCCD3+/SSC 双
11、参数获得 CD3+T 淋巴细胞细胞百分比，根据 APCCD8+/FITCCD3+双参数获得CD3+CD8+双阳的 T 淋巴细胞细胞的百分比，根据 APCCD8+/PEpSLA+获得 CD8+/pSLA+双阳的 T淋巴细胞的百分比，即抗原特异 CTL 细胞的百分比。37结果判定7.1在判定结果前应检查对照样品的结果，具体如下DB32/T 52452025：空白对照，用以排除细胞自发荧光背景，设置最佳的 PMT 电压；单染管对照，设置最佳的荧光补偿；阴性样品，设置圈门界限，CD8+/pSLA+tetramer 双阳的 T 淋细胞的百分比范围 0%10%。如有一标准不符合，结果是无效的，需重新检测和
12、分析。7.2结果计算以 CD8+/pSLA+tetramer 双阳的 T 淋巴细胞比较对象，阳性率按公式（1）计算：P=SN 100%（1）式中：P 阳性率；S 待检测样本 CD8+/pSLA+tetramer 双阳的 T 淋巴细胞；N 阴性对照样本 CD8+/pSLA+tetramer 双阳的 T 淋巴细胞。7.3结果判定当 P2 时，样品为阳性；当 P2 时，样品为阴性。8临床综合判定结合第 7 章中阴阳性样品的检测结果，对猪群 PRRSV 的感染免疫情况进行综合判定，见表 1。表 1 感染免疫情况判定基因型SLA1*040101 以上判断适用于 SLA1*040101 基因型，配合 GP
13、5 肽段（LLDTKGKLY）。在基因型和多肽更换时，应根据流式细胞监测与攻毒保护实验结果对应关系，以 S/N 为 2 进行适度调整设定标准流式结果P2P2综合判定猪群已经感染 PRRSV 野毒或者疫苗免疫后诱导了细胞免疫反猪群未感染 PRRSV 野毒或者疫苗免疫后未诱导细胞免疫反应4附录A（资料性）DB32/T 52452025试剂配制A.1PBS 缓冲液（0.01M，pH 7.2）配制溶液所需试剂如下：8 g 氯化钠（NaCl）；0.2 g 氯化钾（KCl）；1.44 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）；0.2 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）；加双蒸水至 1 000 mL，调节 pH 至 7
14、2，高压灭菌，4 保存备用。A.2FACS 洗涤液在 A.1 中加入 0.01%Proclin 300、0.1%BSA，振荡混匀即可使用。A.3流式检测用酶标抗体和流式抗体稀释液酶标抗体应一直保存在 2 8。使用 A.2 FACS 稀释酶标抗体，按照下表配置酶标抗体工作液，现配现用。未用完的酶标抗体应立即放回至 2 8 条件下保存。表 A.1 酶标抗体工作液配置待检样品个数（细胞数）1（106）酶标抗体体积FITC mouse antipig CD3+（0.5mg/mL），1 L；APC/Alexa Fluor 647 mouse antipig CD8a+（0.2 mg/mL），2 L；P
15、EpSLA+Tetramer（0.4 mg/mL），1 L。酶标抗体稀释液体积196 L5附录B（资料性）DB32/T 52452025阴性对照制备B.1PRRSV 抗原和抗体双阴性猪的筛选参照 GB/T 18090 定量 PCR 和 ELISA 操作规范和结果判定。B.2抗凝血的采集使用 5 mL 或 10 mL 无菌注射器，前腔静脉采血，23 mL/头，避免溶血，尽快转移到真空抗凝管中。28 冷藏运送到实验室，48 h 内分离。B.3猪 PBMC 的分离参照商品化猪外周单个核细胞分离试剂盒的操作步骤进行：抗凝血 23 mL，与稀释液 11 等体积混匀，室温，水平转子 500800 g，最高
16、不超过 1 000 g，离心 2030 min；用吸管小心吸取第二层白色单个核细胞层到另一无菌的 15 mL 离心管中，加入 10 mL 的细胞洗涤液或者 PBS，颠倒混匀，250 g，离心 10 min。弃上清，5 mL 的细胞洗涤液或者 PBS 重悬细胞，重复洗涤 2 次。最后的细胞泥，重悬于 PBS 中，进行细胞计数。所获得的新鲜 PBMC 应立即使用或分装后冻存。如果有红细胞污染，使用商品化红细胞裂解液裂解红细胞。如果未能及时染色进行流式分析，可冻存。B.4PBMC 的计数使用血细胞计数板：将细胞悬液充分混匀后，取少量滴加到血细胞计数板的计数室中，在显微镜下观察并计数。按照计数板的计数
17、规则，计算出一定体积内的细胞数量，然后根据稀释倍数和总体积，计算出细胞的浓度。B.5PBMC 的冻存冻存液配置：RPMI1640 培养基、胎牛血清、DMSO，比例分别为 541。取浓度约为 107个/mL 的细胞沉淀，加入细胞冻存液，轻轻吹打混匀，分装到细胞冻存管，1 mL/管，装到细胞冻存盒中，放-70 保存，转入液氮中保存 24h。B.6PBMC 的复苏从液氮中取出冷冻细胞管，立即投入温水（37 左右）中迅速解冻。将细胞转移入 10 倍量的 RPMI1640 液（pH7.2）中，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清，细胞沉淀使用 FACS 液体重悬，计数，稀释到要求的细胞浓度
18、后，即可使用。B.7PBMC 的染色按照抗体储液浓度与待检测样本数量配置。参照 A.3 操作，配制成 FACS 染色混合液，含有 FITC mouse antipig CD3+、APC mouse antipig CD8a+和 PEpSLA+Tetramer 三种抗体。使用配置的 FACS染色混合液重悬细胞沉淀，200 L/样本，轻轻吹打混匀，4 避光孵育 3060 min。孵育后的细胞悬液，250 g/min，离心 10 min，收获细胞沉淀，重复使用 FACS 洗涤液清洗 2 次，再将细胞沉淀重悬于 FACS 洗6涤液中，200 L/样本，尽快（不超过 4 h）上机分析。B.8DB32/T
19、 52452025结果判定流式细胞检测，设置圈门界限，CD8+/pSLA+tetramer双阳的 T 淋巴细胞的百分比范围 0%10%，判定为阴性对照成立。7附录C（资料性）DB32/T 52452025阳性对照制备C.1PRRSV 疫苗免疫猪商品化 VR2332 活疫苗，接种抗原抗体双阴性猪（参照附录 B 方法筛选），1 头份/头，免疫 30 d 内的抗凝血。C.2猪外周血的采集参照 B.2 操作。C.3PBMC 的分离参照 B.3 操作。C.4细胞冻存液配置参照 B.4 操作。C.5PBMC 的冻存参照 B.5 操作。C.6PBMC 的复苏参照 B.6 操作。C.7PBMC 的染色参照 B
20、7 操作。C.8结果判定流式细胞检测，设置圈门界限，CD8+/pSLA+tetramer 双阳的 T 淋巴细胞的百分比范围 15%40%，判定为阳性对照成立。8附录DB32/T 52452025D（规范性）CD8+/pSLA+tetramer 的制备D.1CD8+/GP5SLA+tetramer 的制备D.1.1设计与构建：将猪群中高频率出现的 SLA1*040101 等位基因及 PRRSV NADC30like 毒株的GP5 蛋白序列输入预测网站，筛选出高亲和力且保守的 GP5 肽段（LLDTKGKLY）。构建特殊结构的融合蛋白，在 链、2m 和 GP5 肽段间插入连接肽（G4S）3，利用
21、 AlphaFold 3 分析确认结构可行。D.1.2重组菌构建与表达：优化 SLA1*040101 等位基因 链、2m 和 GP5 肽段核苷酸序列，在 链羧基端添加 BirA 底物肽序列，插入连接肽后克隆到 pCold I 质粒，转化 BL21（DE3）感受态细胞，构建阳性重组菌。诱导重组菌表达，SDSPAGE 检测，目的蛋白约 45 kDa，且主要在上清中可溶性表达。D.1.3生物素连接酶基因克隆与共转化：以大肠杆菌 DH5 为模板克隆 BirA 基因，构建重组菌 DH5/pET28aBirA，再转化 BL21（DE3）。将 pET28aBirA 与 pCold IGP52m 共转化 BL
22、21（DE3）感受态细胞，筛选双抗性菌株诱导表达，SDSPAGE 和 Western blot 检测目的蛋白及生物素化情况。D.1.4单体纯化与四聚体组装：用镍柱纯化生物素化的 GP5SLA 复合物单体，SDSPAGE 检测纯度90%。将生物素化单体与 PESA 按 41 摩尔比混合，室温避光孵育 3060 min 形成 CD8+/GP5SLA+tetramer。D.1.5质检标准：通过 SDSPAGE 检测蛋白表达、纯化效果，确保目的蛋白条带清晰、纯度达标。利用 Western blot 鉴定目的蛋白生物素化情况，在预期位置出现明显反应性条带视为合格。最终制备的四聚体用于检测时，应能准确区分
23、目标细胞，在流式细胞术检测中，依据设定的对照，准确圈定目标细胞，有效采集细胞信号数量不低于 10 000 个，保证检测结果可靠。D.2CD8+/NSLA+tetramer 的制备D.2.1设计与构建：将猪群中高频率出现的 SLA1*040101 等位基因及 PRRSV NADC30like 毒株的N 蛋白序列输入预测网站，筛选出高亲和力且保守的 N 肽段（TLSDSGRISY）。构建特殊结构的融合蛋白，在 链、2m 和 N 肽段间插入连接肽（G4S）3，利用 AlphaFold 3 分析确认结构可行。D.2.2重组菌构建与表达：优化 SLA1*040101 等位基因 链、2m 和 N 肽段核苷
24、酸序列，在 链羧基端添加 BirA 底物肽序列，插入连接肽后克隆到 pCold I 质粒，转化 BL21（DE3）感受态细胞，构建阳性重组菌。诱导重组菌表达，SDSPAGE 检测，目的蛋白约 45 kDa，且主要在上清中可溶性表达。D.2.3生物素连接酶基因克隆与共转化：以大肠杆菌 DH5 为模板克隆 BirA 基因，构建重组菌 DH5/pET28aBirA，再 转 化 BL21（DE3）。将 pET28aBirA 与 pCold IN2m 共 转 化 BL21（DE3）感 受 态 细胞，筛选双抗性菌株诱导表达，SDSPAGE 和 Western blot 检测目的蛋白及生物素化情况。D.2.
25、4单体纯化与四聚体组装：用镍柱纯化生物素化的 NSLA 复合物单体，SDSPAGE 检测纯度90%。将生物素化单体与 PESA 按 41 摩尔比混合，室温避光孵育 3060 min 形成 CD8+/NSLA+tetramer。D.2.5质检标准：通过 SDSPAGE 检测蛋白表达、纯化效果，确保目的蛋白条带清晰、纯度达标。利用Western blot 鉴定目的蛋白生物素化情况，在预期位置出现明显反应性条带视为合格。最终制备的四聚体用于检测时，应能准确区分目标细胞，在流式细胞术检测中，依据设定的对照，准确圈定目标细胞，有效采集细胞信号数量不低于 10 000 个，保证检测结果可靠。9附录DB32
26、/T 52452025E（资料性）SLA 基因型检测E.1SLA1 引物序列SLA1F：CATGGGGCCTGGAGCCCTCTTCSLA1R：GTGTCCCTCAGTTCCCACAAGGE.2SLA1 序列扩增和检测E.2.1样本准备：抗凝血采集参照 B.2 操作。取适量抗凝血样本，通常为 0.3 mL，置于无菌离心管中。E.2.2细胞裂解：向抗凝血样本中加入 2 倍体积的 RNAiso Blood 试剂，立即剧烈振荡或涡旋混合 15 s30 s，确保血细胞充分裂解。此时细胞内的核酸释放到裂解液中。E.2.3相分离：室温静置 5 min，使裂解物充分反应。随后加入 0.2 倍体积的氯仿，盖紧
27、管盖，剧烈振荡 15 s，再次室温静置 2 min3 min。之后，12 000 g、4 离心 15 min。离心后，溶液会分为 3 层，上层为无色的水相（含 RNA），中间为白色的蛋白质层，下层为红色的有机相。E.2.4RNA 沉淀：小心吸取上层水相转移至新的离心管中，避免吸到中间层的蛋白质。加入 0.5 倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置 10 min。然后 12 000 g、4 离心 10 min，此时 RNA 会沉淀在离心管底部，形成白色或淡白色沉淀。E.2.5RNA 洗涤：弃去上清液，加入 1 mL 75%乙醇（用 DEPC 处理水配制）洗涤 RNA 沉淀。7 500 g、4 离
28、心 5 min，小心弃去上清，尽量去除残留的乙醇，避免 RNA 沉淀丢失。可将离心管短暂开盖，在超净台中晾干或室温放置数分钟，使乙醇充分挥发，但注意不要让 RNA 沉淀完全干燥，以免影响后续溶解。E.2.6RNA 溶解：向干燥后的 RNA 沉淀中加入适量无 RNase 水（一般为 20 L50 L，根据预期 RNA含量调整），轻轻吹打或涡旋振荡，促进 RNA 溶解。可将离心管置于 5560 水浴中孵育 1015 min，加速溶解过程。E.2.7RNA 检测：使用核酸浓度测定仪（如 Nanodrop）测定 RNA 的浓度和纯度，评估提取效果。对于高质量、纯度高的 RNA 样品，A260/280
29、比值通常在 1.82.1 之间。E.3SLA1*0401 特异性扩增序列（1117bp）5CATGGGGCCTGGAGCCCTCTTCCTGCTGCTGTCGGGGACCCTGGCCCTGACCGGGACCCAGGCGGGTCCCCACTCCCTGAGCTATTTCTACACCGCCGTGTCCCGGCCCGACCGCGGGGACTCTCGCTTCATCGCCGTCGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAACTACGCCCCGAATCCGCGGATGGAGCCTCGGGTGCCGTGGATACAGCAGGAGGGGCAGGAGTATTGGGATCGGGAGAC
30、GCGGAATGTCAAGGAAACCGCACAGACTTACGGAGTGGGCCTGAACACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCAGAGCATGTACGGCTGCTACTTGGGACCAGACGGGCTCCTCCTCCACGGGTACAGACAGGACGCCTACGACGGCGCCGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCGATGAGGCGGAGCGTAGGAGGAGCTACCTGCAGGGACTGTG
31、TGTGGAGTCGCTCCGCAGATACCTGGAGATGGGGAAGGA10DB32/T 52452025CACGCTGCAGCGCGCAGAGCCTCCAAAGACACATGTGACCCGCCACCCCAGCTCTGACCTCGGGGTCACCTTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTAAGGAGATCTCCCTGACCTGGCAGCGGGAGGGCCAGGACCAGAGCCAGGACATGGAGCTGGTGGAGACCAGGCCCTCAGGGGATGGGACCTTCCAGAAGTGGGCGGCCCTGGTGGTGCCTCCTGGAGAGGAGCAGAGCTACACC
32、TGCCATGTGCAGCACGAGGGCCTGCAGGAGCCCCTCACCCTGAGATGGGACCCTGCTCAGCCCCCCGTCCCCATCGTGGGCATCATTGTTGGCCTGGTTCTGGTCCTGGTCGCTGGAGCCATGGTGGCTGGAGTTGTGATCTGGAGGAAGACGCGCTCAGGTGAAAAAGGAGGGAGCTACACTCAGGCTGCAGGCAGTGACAGTGACCAGGGCTCCGATGTGTCCCTTACCAAGGATCCTAGAGTGTGAGACAGCTGCCTTGTGGGAACTGAGGGACAC3E.4对猪群 SLA1 优势等位基因及频率检测SLA1 等 位 基 因 及 其 频 率 分 别 为：SLA1*040101（15%）、SLA1*1402（13%）、SLA1*0402（10%）、SLA1*1301（10%）以及 SLA1*1401（10%）。SLA1*040101 在 PK15 细胞系中普遍表达。11
