1、7,江苏省市场监督管理局发 布中 国 标 准 出 版 社出 版饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测 重组酶介导等温核酸扩增法CCS C 62ICS 11.020DB32/T 53622026-04-03 发布2026-05-03 实施2026Detection of cryptosporidium and giardia lamblia in drinking waterRecombinaseaided amplification assy前言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 仪器与设备 15 试剂与材料 26 水样富集和核酸提取 27 核酸检测 38 结果判定
2、 4附录 A（规范性）RAA 基础反应体系溶液5附录 B（规范性）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增特异性基因的引物和探针6附录 C（规范性）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增反应体系 7参考文献 DB32/T 536220268目 次DB32/T 53622026前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省血吸虫病防治研究所。本文件主要起草
3、人：曹俊、戴洋、丁昕、姚甲凯、陈玉英、张强、倪碧娴、王强、刘东阳。饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测 重组酶介导等温核酸DB32/T 53622026扩增法1范围本文件描述了重组酶介导核酸等温扩增法检测饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫。本文件适用于各类出厂水和末梢水的检测与监测工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1隐孢子虫Cry
4、ptosporidium属于真球虫目，隐孢子虫科，隐孢子虫属的重要的机会致病性原虫。注 1：生活史有滋养体、裂殖体、配子（体）、合子和卵囊 5 个发育阶段，其中卵囊是感染阶段，可存在于饮用水中。注 2：感染人体后，主要寄生于小肠上皮细胞的刷状缘纳虫空泡内，可引起隐孢子虫病。3.2蓝氏贾第鞭毛虫Giardia lamblia贾第鞭毛虫，属于双滴虫目，六鞭毛科，贾第鞭毛虫属。生活史包括滋养体和包囊 2 个发育阶段，其中包囊是感染阶段，可存在于饮用水中。感染人体后，主要寄生于人体十二指肠、小肠上端和胆囊，可引起蓝氏贾第鞭毛虫病。注：贾第鞭毛虫简称蓝氏贾第鞭毛虫，又称肠蓝氏贾第鞭毛虫或十二指肠蓝氏贾第
5、鞭毛虫。3.3重组酶介导等温核酸扩增技术Recombinaseaided amplification；RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白和 DNA 聚合酶在等温条件下（一般为 39）进行核酸扩增的技术。注：其原理为重组酶与引物紧密结合扫描双链 DNA，当搜索到与引物同源的序列时，使双链 DNA 解旋，单链结合蛋白防止单链 DNA 复性，引物在与 DNA 聚合酶作用下沿模板延伸，合成新的 DNA 互补链，5 min15 min 就可实现用仪器检测目的靶标的扩增。4仪器与设备4.1水样富集装置该方法所需装置如下：1a）过滤器：用于进出水样和承载固定滤膜；b）滤膜：聚丙烯（Polypropylene
6、PP）纤维滤膜，孔径 1 m2 m，直径 8 cm10 cm；c）橡胶软管；d）快速接头/口：用于连接各部分组件；e）流量计。4.2DB32/T 53622026核酸提取设备该方法所需设备如下：a）恒温水浴锅：可加热至 100；b）高速离心机：相对离心力12 000 g；c）超声破碎仪：20 kHz，500 W700 W；d）微量可调移液器：量程为 100 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L 以及0.1 L2.5 L。4.3核酸检测设备该方法所需设备如下：a）RAA 恒温核酸扩增检测仪：带有恒温（391）扩增功能、荧光定量系统及计算机处理系统的荧光检测仪
7、需具备 FAM（6羧基荧光素）和 HEX（六氯6甲基荧光素）两种荧光通道；b）恒温震荡混匀仪：带有恒温功能（391），且能把固体、液体物质充分混匀，用于核酸样本和反应试剂的恒温混合；c）离心机：相对离心力12 000 g；d）微量可调移液器：量程为 100 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L 以及0.1 L2.5 L。e）掌式离心机：0 r/min2 000 r/min。5试剂与材料5.1试剂组织核酸提取试剂盒、RAA 基础反应体系溶液（也可采用等效的扩增反应试剂盒）：见附录 A 的表A.1。乙酸镁溶液（140 mmol/L），无水乙醇，试验用水（符合
8、GB/T 6682 要求）。5.2材料离心管（50 mL、15 mL、1.5 mL）、PCR 管（0.2 mL）及管架、微量可调移液器及配套吸头、培养皿、眼科剪、眼科镊、一次性医用手套和一次性医用口罩。5.3引物和探针扩增隐孢子虫属特异性的 18S rRNA 基因以及蓝氏贾第鞭毛虫 贾第素（giardin）基因的特异性引物及探针，见附录 B 的表 B.1。6水样富集和核酸提取6.1水样富集6.1.1样本及采样量样本包括自来水厂出厂水、末梢水，且不低于 50 L。26.1.2DB32/T 53622026采样富集过程采用滤膜拦截过滤的方法，利用自来水压完成富集，按以下步骤采样：a）将滤膜安置固定
9、于过滤器进水口侧；b）将过滤器前后组装完整，确保密封；c）将组装完毕的过滤器通过快速接头/口和橡胶软管连接于自来水龙头后；d）利用快速接头/口和橡胶软管将流量计连接于过滤器后面；e）记录流量计数值，打开水龙头，利用自来水压进行过滤富集；f）关闭自来水龙头，记录流量计数值并计算过滤体积；g）将过滤器从连接处卸下；h）打开过滤器，用镊子夹取滤膜边缘后取出。注 1：出厂水是指水源水经水厂集中处理后，即将进入输配水网管的水。注 2：末梢水是指经过输配水管网输送至用户水龙头的水。注 3：本部分富集方法为现场采样，采集完毕后将滤膜装入 50 mL 离心管中，并尽快送至实验室，运输条件则需确保0 4 冷藏。
10、富集完成后需在 24 h 内完成核酸提取和检测步骤。注 4：加标水样和试验用水分别作为本方法的阳性对照和阴性对照，与水样富集步骤一致。6.2核酸提取按照以下步骤进行核酸提取：a）用无菌眼科剪将滤膜剪成碎片，装入 15 mL 离心管中；b）向上述离心管中加入 10 mL 溶菌酶（50 mg/mL）和 500 L 蛋白酶 k（20 mg/mL），充分混匀后置于水浴锅中 50 孵育 60 min；c）再向上述样品管中加入 1 mL 玻璃珠（直径 1mm2 mm），并置于超声破碎仪中超声 60 min（超声功率为 25 kHz 36 kHz），工作 10 s 间隔 10 s；d）将上述样本置于高速离心
11、机，13 000 r/min 离心 2 min；e）取离心后的上清液，按照组织核酸提取试剂盒的操作说明完成核酸提取；提取的核酸进行下一步核酸检测，或保存至（-205）备用。注：本步骤是为了将蓝氏贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫卵囊囊壁充分破碎，以释放内部核酸。7核酸检测7.1反应体系扩增反应体系见附录 C 的表 C.1；用双蒸水溶解稀释引物探针至 10 mol/L。7.2反应步骤按照以下步骤进行：a）按照附录 A 的要求配制基础反应体系；b）将配置好的反应体系溶液按照附录 C 进行混合；c）将上述混合物共 40 L 转移至 200 L PCR 管中，并用掌式离心机混匀；d）向 PCR 管的管盖内侧加入
12、 5 L 乙酸镁溶液；e）向 PCR 管中分别加入 5 L 待测核酸；f）将 PCR 管置于恒温震荡混匀仪中，39 下运行 4 min；3g）将 PCR 管置于 RAA 恒温核酸扩增检测仪（也可采用其他等效的荧光检测仪）中进行实时检测；h）设置反应温度 39，时间 30 minDB32/T 53622026。8结果判定8.1阳性判定8.1.1反应结束后，设置斜率（荧光值 mV/时间 min）为 20。8.1.230 min 内，通道一 FAM 荧光信号扩增曲线的斜率20 时判定为蓝氏贾第鞭毛虫阳性；否则判定为阴性。8.1.330 min 内，通道二 HEX 荧光信号扩增曲线的斜率20 时判定为
13、隐孢子虫阳性；否则判定为阴性。8.2质量控制8.2.1FAM 通道和 HEX 通道：加标水样检测结果判定为阳性；试验用水检测结果判定为阴性。8.2.2如果检测结果不符合 8.2.1 的要求，该检测结果视为无效，应检查仪器、试剂等的偏差，确认无误后重新检测。注：加标水样是指在试验用水中加入隐孢子虫卵囊和蓝氏贾第鞭毛虫包囊各 10010 个后制成的水样。4附录A（规范性DB32/T 53622026）RAA 基础反应体系溶液表 A.1 给出了 RAA 基础反应体系溶液的组分和浓度。表 A.1 RAA 基础反应体系溶液组分Tris 缓冲液醋酸钾二硫苏糖醇聚乙二醇（PEG35000）ATPdNTPs磷
14、酸肌酸单链结合蛋白重组酶UvsY 蛋白核酸外切酶DNA 聚合酶浓度30 mmol/L100 mmol/L6 mmol/L质量分数为 6%5 mmol/L0.4 mmol/L80 ng/L500 ng/L200 ng/L200 ng/L200 ng/L150 ng/L5附录B（规范性DB32/T 53622026）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增特异性基因的引物和探针表 B.1 给出了隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增特异性基因的引物和探针。表 B.1 隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增特异性基因的引物和探针引物/探针隐孢子虫正向引物隐孢子虫反向引物隐孢子虫探针 a蓝氏贾第鞭毛虫正
15、向引物蓝氏贾第鞭毛虫反向引物蓝氏贾第鞭毛虫探针 b a HEX 为荧光报告基团，BHQ1 为荧光淬灭基团。b FAM 为荧光报告基团，idSp 为四氢呋喃。序列（53）ATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGCTCCAATTGATACTYGTWAAGGGGTTTATACCGCAAATTACCCAATCCTRAYACAGGGAGG/i6HEXdT/A/idSp/iBHQ1dT/GACAAGAAATAACAATC3spacerCTCAGGAAGGAGGCCCTCAAGAGCCTGAACGATCTCGCGGGCGATCGTCTCCTTCTCGATSGCTYGCCACGGAGAACGC
16、MGARAGGAAGAAGA/i6FAMdT/idSp/iBHQ1dT/AYGACCAGCTCAACGCC3spacer6附录C（规范性DB32/T 53622026）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增反应体系表 C.1 给出了隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增反应体系。表 C.1 隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA 扩增反应体系组分双蒸水反应体系溶液隐孢子虫正向引物隐孢子虫反向引物隐孢子虫探针蓝氏贾第鞭毛虫正向引物蓝氏贾第鞭毛虫反向引物蓝氏贾第鞭毛虫探针体积/L9.85251.251.250.35110.37DB32/T 53622026参 考 文 献1 周晓农，陈家旭.食源性寄生虫病.北京：人民卫生出版社.2009：139143.2 吴观陵.人体寄生虫学（第四版）.北京：人民卫生出版社.2013：611621.3 诸欣平，苏川.人体寄生虫学（第十版）.北京：人民卫生出版社.2024：4675.4 倪碧娴，吴小珉，刘燕红，等.重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价 J.中国血吸虫病防治杂志，2019，31（4）：388392，399.5 倪碧娴，刘燕红，徐祥珍，等 重组酶介导的蓝氏贾第鞭毛虫特异性等温核酸扩增方法的建立及评价J.中国血吸虫病防治杂志，2020，32（4）：345349.8
