1、 ICS 65.150 CCS B 52 34 安徽省地方标准 DB34/T 54062026 棘胸蛙 Chinese spiny frog 2026-01-05 发布 2026-02-05 实施安徽省市场监督管理局 发 布DB34/T 54062026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽农业大学、宁国市民鸿农业科技有限公司、宁国市金鼎家庭农场、池州市贵池区人民政府江口街
2、道办事处、泾县畜牧兽医水产服务中心（泾县动物卫生监督所）、芜湖市渔业管理服务中心、庐江县龙桥镇人民政府农业农村工作办公室。本文件主要起草人：苏时萍、常芹芹、刘鑫、吴谢强、秦迎春、左爱民、汪百才、曲春娟、侯文琦、李西雷、万志程、陈啸、宋彩霞、张自成、唐珂嘉。DB34/T 54062026 1 棘胸蛙 1 范围 本文件确立了棘胸蛙（Quasipaa spinosa，David,1875）的学名与分类，规定了棘胸蛙种质鉴定的主要形态构造特征、生长与繁殖、细胞遗传学和生化遗传学特性，描述了相应的检测方法，规定了判定规则。本文件适用于棘胸蛙的种质检测与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的
3、规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分:抽样方法 GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第6部分:繁殖性能的测定 GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分:染色体组型分析 GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第14部分:DNA含量的测定 GB/T 25884 蛙类形态性状测定 GB/T 45060 黑斑侧褶蛙 3 术语和定义 GB/T 25884 和 GB/T 45060 界定的术语和定义适用
4、于本文件。4 学名和分类 学名 棘胸蛙（Quasipaa spinosa（David,1875）。注：别名：石蛤、石鸡、石蛙等 分类地位 脊索动物门（Chordata），脊椎动物亚门（Vertebrata），两栖纲（Amphibia），无尾目（Anura），叉舌蛙科（Dicroglossidae），棘胸蛙属（Quasipaa）。5 主要形态结构特征 外部形态特征 5.1.1 外形 DB34/T 54062026 2 成体背面黑棕色或棕黄色，散布着不规则分布的疣状物。四肢背面黑褐色，横纹直达指、趾端。腹面肉色，有灰褐色小云斑。皮肤较粗糙，雄蛙胸部有大小肉质疣刺，刺疣向前可达咽喉部，雌蛙腹面光滑。
5、成体头宽大于头长，吻端圆，下唇突出，吻棱不显，颊部略向外倾斜。鼻孔在吻眼之间，略近于眼，眼后方有横置的肤沟，颞褶十分显著。鼓膜不明显。犁骨齿强，舌卵圆形，后端缺刻深。前臂和指长近于体长 1/2，指略扁，指端圆，第一指长于第二指；第二、第三指内侧缘蹼清晰，原拇指发达，指基部关节下瘤明显，近球形。掌突 3 个，内掌突大，卵圆形。后肢粗壮，胫长约为体长 1/2，趾端球形，第一、第五趾游离侧缘膜明显，达蹠基部，趾全蹼。关节下瘤明显近圆形；跗褶清晰，超过跗长 1/2。雄蛙第二性征明显，胸部有大小疣刺，前臂极粗壮，原拇指及内侧三指有黑色锥状刺。棘胸蛙成体外形见图1，棘胸蛙雌、雄背、腹面观见图2.图1 棘胸
6、蛙外形图（侧面观）图2 棘胸蛙背、腹面观（左雌、右雄）5.1.2 可量性状 棘胸蛙实测可量性状比例值见表1。表1 棘胸蛙实测可量性状比例值 单位为厘米 体长范围 体长/头长 头宽/头长 后肢长/体长 足长/前臂长 跗足长/胫长 4.505.50 3.340.37 1.280.05 1.490.07 1.120.10 1.310.10 DB34/T 54062026 3 体长范围 体长/头长 头宽/头长 后肢长/体长 足长/前臂长 跗足长/胫长 5.506.50 3.360.33 1.290.01 1.440.10 1.100.01 1.380.25 6.507.50 3.360.35 1.31
7、0.10 1.430.12 1.220.04 1.320.16 7.508.50 3.380.27 1.350.15 1.420.06 1.150.14 1.370.29 8.509.50 3.480.54 1.360.20 1.410.07 1.140.07 1.410.33 9.510.50 3.670.32 1.350.13 1.350.10 1.190.13 1.460.48 内部结构 5.2.1 声囊 雄蛙咽部有 1 对内声囊，开口于口咽腔；雌蛙无声囊。5.2.2 脊椎 脊椎骨 10 枚，其中颈椎骨 1 枚、躯椎骨 7 枚、荐椎骨 1 枚、尾杆骨 1 枚。属前凹后凸的参差型椎体。5.
8、2.3 生殖系统 5.2.3.1 雄蛙有一对浅黄色椭圆形睾丸，位于腹腔背侧、肾前腹面，睾丸前有金黄色指状脂肪体，数量与大小因个体和发育阶段而异。5.2.3.2 雌蛙具一对多叶囊状卵巢，位于腹腔背侧、肾前腹面，生殖期膨大并含大量黄黑色卵粒。卵巢前有一对金黄色脂肪体，数量与大小因个体和发育阶段而异。6 生长和繁殖特性 生长 棘胸蛙的体长与体重实测值见表2。表2 棘胸蛙体长与体重实测值 体长范围/cm 4.505.50 5.506.50 6.507.50 7.508.50 8.509.50 9.5010.50 体重范围/g 13.7917.95 17.1962.5231.0264.3063.8410
9、0.4065.59133.48 140.56-164.78繁殖 6.2.1 性成熟年龄 雌、雄蛙性成熟年龄均为 2 龄。6.2.2 产卵季节 产卵的季节为 49月，产卵盛期为 57月，一般雌性每年产卵 23 次。6.2.3 产卵水温 适宜产卵水温为 1824。DB34/T 54062026 4 6.2.4 产卵类型 产粘性卵，具胶质外膜；多次产卵，每年产卵 23 次。卵球形，卵径 1.2 mm1.5 mm，动物极深棕色,植物极淡黄色。6.2.5 绝对怀卵量 产卵量随雌体的大小而异，一般一年总产卵量为 10002800 粒。7 遗传学特性 细胞遗传学特征 体细胞染色体数：2n26；核型公式：2n
10、18m+4sm+4st；染色体臂数：NF=44。染色体核型图见图3 A），染色体组型见图3 B）。A)B)图中：m 中部着丝点染色体；sm 亚中部着丝点染色体；st 亚端部着丝点染色体。图3 棘胸蛙染色体组型（2n=26）分子遗传学特性 7.2.1 棘胸蛙线粒体 Cytb 基因为 817 bp，电泳图谱（Marker 为 DL 1000)见图 4。图4 棘胸蛙线粒体 Cytb 基因电泳图谱 DB34/T 54062026 5 7.2.2 棘胸蛙线粒体 DNA 样本扩增片段测序后与棘胸蛙线粒体 Cytb 基因标准序列进行同源比对，同源性为 100。棘胸蛙线粒体 Cytb 基因如下：5-AACA
11、CAATTCTTTCACTATTTCTACTAGGATTTTAACCTAGACTGATAGTCTGAAAAACTACTGTTGTACTTCAACTATAAAAACCTATTCTATGGCCCCAGCCCGAAAATCTCACCCAATCTTAAAAATTATTAACTATGCATTTATTGACCTCCCTGCCCCAGCAAATTTGTCTTCTTGATGAAACTTTGGCTCCCTCCTCGGACTCTGCTTAATTATCCAAATCGCACAGGCCTATTTCTTGCAATACACTATACAGCAGACACATCTATAGCCTTTTCATCAATTGCCCATATTTGTCGG
12、GATGTAAACAACGGCTGACTCCTTCGCAACCTTCACGCCAACGGAGCCTCCTTCTTTTTTATCTGCATCTATTTACACATTGGCCGAGGTTTATATTATGGATCATTCCTTTTCATGGAAACCTGAAACGTAGGTGTAATCCTCCTTTTTTTAGTCATAGCCACAGCCTTTGTCGGATATGTTCTACCATGAGGCCAAATATCCTTCTGAGGCGCTACAGTCATTACTAACCTCCTCTCAGCCGCCCCCTATATCGGTACTAACCTAGTCCAATGAATCTGGGGCGGCTTCTCAGTAGAC
13、AATGCCACCCTAACCCGATTCTTCTCTTTCCACTTTATTCTCCCTTTCGCTATCGCCGGGGCAAGCATAATCCACTTATTATTCCTCCATCAAACAGGATCATCCAATCCAACCGGCCTTAATCAAAATCTAGATAAAGTCCCCTTCCACTCTTATTTCTCTTACAAAGACCTCCTCGGATTCGCTATTATAGTTGGCGCACTAGCGGGTCTATCAACCTTCTCCCCAAACCTCCTAGGTGACCCAGACAATTTTACACCAGCAAA-3 8 检测方法 抽样 按 GB/T 18654.2 的规定执行。
14、随机抽取蛙池，生物学检测样本不少于 30 只，繁殖检测雌、雄蛙样本各不少于 15 只。主要形态构造特征测定 8.2.1 外部形态特征 8.2.1.1 外形观察 自然光下观察。8.2.1.2 可量性状和可数性状的测定 按 GB/T 25884 的规定执行。8.2.2 内部结构特征 8.2.2.1 脊椎骨的测定 解剖、蒸煮剔肉，取整条脊椎骨，观察脊椎骨数量。8.2.2.2 生殖系统的检测方法 自然光下观察，辨别雌雄，剖开腹腔观察生殖系统各器官的形态特征。生长与繁殖 8.3.1 性成熟年龄鉴定 8.3.1.1 样品采集与固定 DB34/T 54062026 6 剪取棘胸蛙第 2 趾骨，清洗晾干后，投
15、入 80乙醇中固定硬化 1015 小时，年龄鉴定相关试剂见附表A.1。8.3.1.2 脱钙处理 将固定后的样品经蒸馏水短暂冲洗，移入 3硝酸水溶液中脱钙约 24 小时。脱钙终点判断标准为针尖轻刺无硬芯、质地柔软。脱钙完成后，以流水冲洗 24 小时，彻底去除残留酸液。8.3.1.3 石蜡切片与染色 8.3.1.3.1 脱水透明：样品依次经梯度乙醇（70809095100I100II）脱水，每级 11.5 小时；随后移入二甲苯中至组织完全透明。8.3.1.3.2 浸蜡包埋：将透明样品置于 5658石蜡中浸渍 23 次，每次1 小时；包埋时使趾骨长轴垂直于切片方向，以利观察年轮。8.3.1.3.3
16、切片与贴片：用旋转式石蜡切片机连续切片，厚度 58 m，于 42温水中展平，载玻片捞片后 60烘干。8.3.1.3.4 H&E 染色、脱蜡至水：依次经二甲苯 2 次、梯度乙醇（100958070）至蒸馏水；苏木精染色 510 分钟，1盐酸乙醇分化，流水返蓝；0.5伊红复染 13 分钟；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。8.3.1.4 年轮观察与判读 显微镜（1020）下观察，可见黑色狭窄带（年轮标志）与淡红色宽带相同排列，1个黑色带计为1 龄，依此类推。8.3.2 生长的测定 按 GB/T 25884 的方法测量。8.3.3 绝对怀卵量的测定 解剖棘胸蛙亲本，取出卵巢，按 GB/T 18
17、654.6 的方法测定。染色体检测 8.4.1 染色体制备 8.4.1.1 试剂 染色体检测相关试剂见附表A.2。8.4.1.2 预处理 在取样前 46 h，按每克体重 1015 g的剂量，通过腹腔注射秋水仙素溶液。8.4.1.3 取样与低渗 解剖后，取股骨与胫骨骨髓，置于0.2KCl溶液中，37水浴低渗 2030 min。8.4.1.4 固定 DB34/T 54062026 7 以 1500 r/min 离心 10 min，弃上清；加入 4 mL 固定液（甲醇:冰乙酸=3:1），37固定 15 min；重复固定 2 次。8.4.1.5 制片与染色 加入少量固定液制备细胞悬液，滴片，文火烘干；
18、用吉姆萨（Giemsa）工作液（按 GB/T 18654.12的规定配制）染色 30 min；蒸馏水冲净染液，空气干燥后即可用于观察。8.4.2 染色体计数与核型分析 按 GB/T 18654.12 的规定执行。分子遗传特征检测 8.5.1 试剂 分子遗传学检测相关试剂见附表A.3。8.5.2 样品制备、DNA 提取与 PCR 扩增 样品制备、基因组DNA提取及PCR扩增的其他步骤按 GB/T 18654.14 的规定执行。扩增靶点：线粒体Cytb基因。引物序列：F:5ATAAGGAGACGGATTTGAA3 R:5AAGTATAGGGTAGAGGCAA3 PCR反应体系：50 L。扩增程序：
19、94预变性 5 min；94变性 30 s，52退火 30 s，72延伸90 s，共 35 个循环；72终延伸 10 min。8.5.3 PCR 产物纯化与回收 取 5 L扩增产物，经 1.5琼脂糖凝胶电泳检测后，切取目的条带，使用凝胶回收试剂盒进行纯化与回收。8.5.4 测序 将纯化后的 PCR产物进行正、反双向测序。8.5.5 序列分析 对获得的线粒体 Cytb 基因序列进行比对与分析。9 判定规则 当检测结果符合第 5 章要求时,可判定该物种。当外部形态特征符合本文件规定,而可量性状不符合本文件规定或与本文件规定有明显差异时，则应结合其他指标综合判定。当出现下列情况之一，需增加检测其他章
20、节要求内容，依据检测结果对物种进行综合判定。a)必要时,检测第 7 章或第 8 章的内容；DB34/T 54062026 8 b)第三方提出要求检测第 6 章全部或部分内容时；c)全项检测时。DB34/T 54062026 9 附录A （资料性）主要试剂配制方法 主要试剂配制方法见表A.1表A.3。表A.1 年龄鉴定相关试剂 试剂名称 浓度/配方 配制方法 乙醇固定液 80(v/v)量取 800 mL 无水乙醇，加入 200 mL 蒸馏水，混匀。硝酸脱钙液 3(v/v)量取 30 mL 浓硝酸，缓慢加入到 970 mL 蒸馏水中，混匀。Harris 苏木精染液-1.称取 1 g 苏木精溶于 1
21、0 mL 无水乙醇。2.称取 20 g 硫酸铝钾溶于 200 mL 水，加热溶解。3.将两液混合，加热至沸腾后，缓慢加入 0.5 g 氧化汞。4.溶液变紫后迅速冷却，加入 8 mL 冰醋酸，过滤后使用。伊红染色液 0.5(w/v)称取 0.5 g 伊红，溶于 100 mL 95乙醇中，搅拌至完全溶解。盐酸乙醇分化液 1(v/v)量取 1 mL 浓盐酸，与 99 mL 70乙醇混合均匀。表A.2 染色体检测相关试剂 试剂名称 浓度/配方 配制方法 秋水仙素储备液 100g/mL 称取 10 mg 秋水仙素，溶于 100 mL 生理盐水（0.9 NaCl）中。氯化钾低渗液 0.2(w/v)称取 2
22、 g 氯化钾，溶于 1000 mL 蒸馏水中，混匀。固定液 甲醇:冰乙酸=3:1(v/v)量取 300 mL 无水甲醇与 100 mL 冰乙酸，于具塞玻璃瓶中充分混合。表A.3 分子遗传学检测相关试剂 试剂名称 浓度/配方 配制方法 TAE电泳缓冲液(50)-称取 242 g Tris碱，加入 57.1 mL 冰乙酸和 100 mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加蒸馏水定容至 1000 mL。琼脂糖凝胶 1.5(w/v)称取 1.5 g 琼脂糖，溶于 100 mL 1TAE 缓冲液中，加热溶解后冷却，加入核酸染料混匀。凝胶加样缓冲液(6)-称取 25 mg 溴酚蓝，溶于 6 mL 甘油中，加蒸馏水定容至 10 mL。
