1、GB 中华人民共和国国家标准GB 4789.38-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数2012-05-17发布2012-07-17实施i1t:lJ$_ 段。，四时代忡:r 数码防伪中华人民共和国卫生部发布前言本标准代替GBjT4789. 382008(食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数。本标准与GBjT4789.38一2008相比，主要变化如下:一一修改了标准的中文名称;一一修改了培养基和试剂;GB 4789.38-2012 一一将第二法大肠杆菌VRB-MUG平板计数法改为大肠埃希氏菌平板计数法(第二法) ; 一一删除了第三法大肠杆菌Petrifilrn测试片计数法;一一修
2、改了附录AoI GB 4789.38-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数1 范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌CEscherichiacoli)计数的方法。本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法(第二法)不适用于贝类产品。2 术语和定义2. 1 大肠埃希氏菌Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5.C发酵乳糖产酸产气，IMViCC蘸基质、甲基红、VP试验、拧攘酸盐)生化试验为十十一一或一+一一的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。2.2 最可
3、能数基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下za) 恒温培养箱:36.C :l: 1 .C; b) 冰箱:2.C-5 .C; c) 恒温水浴箱:44.5c士0.2.C; d) 天平:感量为0.1g; e) 均质器;f) 振荡器;g) 元菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mLC具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头;h) 元菌锥形瓶:容量500mL; i) 元菌培养皿:直径90mm; j) pH计或pH比色管或精密pH试纸Fk) 菌落计数器;1) 紫外灯:波长360nm-366 nm，功率运6W. 4 培养基和试剂4
4、. 1 月桂基硫酸盐膜蛋白陈CLST)肉汤:见附录A中A.1.4.2 EC肉汤CE.coli broth) :见附录A中A.2. 1 GB 4789.38-2012 4.3 蛋白陈水:见附录A中A.304.4 缓冲葡萄糖蛋白豚水甲基红(MR)和V-p试验用:见附录A中A.4。4.5 西蒙氏拧棱酸盐培养基:见附录A中A.5。4.6 磷酸盐缓冲液z见附录A中A.6。4. 7 伊红美蓝(EMB)琼脂:见附录A中A.7。4.8 营养琼脂斜面:见附录A中A.8。4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA):见附录A中A.9。4. 10 结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酣-D-葡萄糖昔琼脂(VRBA-MUG):
5、见附录A中A.I004. 11 革兰氏染色液:见附录A中A.ll。4.12 Kovacs桂基质试剂:见附录A中A.12。4. 13 元菌1mol/L NaOH:见附录A中A.1304. 14 元菌1mol/L HCl:见附录A中A.1405 大肠埃希氏菌MPN计数第一法)5. 1 检验程序大肠埃希氏菌MPN计数的检验程序见图10检样25吕(mL)样品+225mL稀释液，均质选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LSl肉汤管可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板36C土1Cf 18 h-24 h 图1大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序2 GB 4789.38-2012 5.2 操作步骤5.2. 1 样晶的
6、稀释5. 2. 1. 1 固体和半固体样品:称取25g样品，放入盛有225rnL磷酸盐缓冲液的元菌均质杯内，8 000 r/rnin10 000 r/rnin均质1rnin2 rnin，制成1: 10样品匀液，或放入盛有225rnL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1rnin 2 rnin制成1: 10的样品匀液。5.2.1.2 液体样品:以元菌吸管吸取25rnL样品置盛有225rnL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的元菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1: 10的样品匀液。5.2. 1. 3 样品匀液的pH应在6.57. 5之间，必要时分别用1rnol/L NaOH或1rno
7、l/L HCl调节。5.2. 1. 4 用1rnL元菌吸管或微量移液器吸取1: 10样品匀液1rnL，沿管壁缓缓注入9rnL磷酸盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1rnL元菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1: 100的样品匀液。5.2. 1. 5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1rnL元菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15rnin. 5.2.2 初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)，每个稀释度接种3管月桂基硫
8、酸盐膜蛋白陈CLST)肉汤，每管接种1rnLC如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤)，36.C:l:1 .C培养24h士2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24h土2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48h:l: 2 h。产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。5.2.3 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于己提前预温至45.C的EC肉汤管中，放入带盖的44.5 .C :l: O. 2 .C水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h土2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h士2h。记录
9、在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希民菌MPN结果;如有产气者，则进行EMB平板分离培养。5.2.4 伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36.C :l: 1 .C培养18h24 h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或元光泽的典型菌落。5.2.5 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5个典型菌落，如元典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36.C土1.C，培养18h24 h.取培养物进行革兰民染色和生化试验。5.2.6 鉴定取培养物进行蘸基质试验、MR-VP试验和拧攘酸
10、盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表1.3 GB 4789.38-2012 表1大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别奇主基质(l)甲基红(MR)VP试验(VP)拧橡酸盐(C)鉴定(型别)+ + 典型大肠埃希氏菌+ 非典型大肠埃希氏菌+ + + 典型中间型十十非典型中间型+ + 典型产气肠杆菌+ 十+ 非典型产气肠杆菌注1:如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。注2:生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作。5.3 大肠埃希氏菌MPN计数的报告大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵
11、乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为+一一或一十一一。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希民菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表(见附录B)，报告每g(mL)样品中大肠埃希氏菌MPN值。6 大肠埃希氏菌平摄计数法(第二法)6. 1 检验程序大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图2。检样25 g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择2个-3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRBA-MUG平板36 c :t 1 C. 18 h-24 h 紫外灯照射，计数发荧光菌落报告结果圈2大肠埃希氏菌平板计数法检验程序6.2 操作步骤6.2.1 样晶的稀释按5
12、.2.1进行。4 GB 4789.38-2012 6.2.2 平板计数6.2.2. 1 选取23个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个元菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。6.2.2.2 将10mL15 mL冷至45.C土0.5.C的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分漉匀。待琼脂凝固后，再加3mL4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36.C士1.C培养18h24 h。6.3 平板菌落数的选择选择菌落数在10CFU100 CFU之间的平板，暗室中360nm366 nm波长紫外灯照射下，计数
13、平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用己知MUG阳性菌株(如大肠埃希氏菌ATCC25922)和产气肠杆菌(如ATCC13048)做阳性和阴性对照。6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g(mL)样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。5 GB 4789.38-2012 A.1 月桂基葡酸盐膜蛋白脏(LST)肉汤A. 1. 1 成分A. 1.2 制法膜蛋白陈或膜酷陈氯化铀乳糖磷酸氢二饵(KzHP04)磷酸二氢饵(KHzP04)月桂基硫酸铀蒸锢水pH6.8士0.2附
14、录A培养基和试剂20.0 g 5.0 g 5.0 g 2. 75 g 2.75 g 0.1 g 1 000.0 mL 将上述成分溶解于蒸馆水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mLo 121 oC高压灭菌15min。制备双料LST肉汤时，除蒸馆水外其他成分加倍。A.2 EC肉汤(E.coli broth) A. 2.1 成分A.2.2 制法膜蛋白陈或膜醋陈3号胆盐或混合胆盐乳糖磷酸氢二饵(KzHP04)磷酸二氢饵(KHzP04)氯化铀蒸锢水pH6.9士O.1 20.0 g 1. 5g 5.0 g 4.0 g 1. 5g 5.0 g 1 000.0 mL 将上述成分溶解于蒸锢水中，
15、调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管8mLo 121 oc高压灭菌15mino A.3 蛋白臆水A. 3.1 成分膜陈或膜酷陈10.0 g 6 、.GB 4789.38-2012 蒸锚水1 000.0 mL pH6.9土0.2A.3.2 制法加热搅拌溶解膜陈或膜酷豚于蒸锚水中。分装试管，每管5mL 121 .C高压灭菌15min. A.4 缓冲葡萄精蛋白脏水甲基红(MR)和平P试验用A. 4.1 成分多豚7.0 g 葡萄糖5.0 g 磷酸氢二饵(K2HP04)5.0 g 蒸馆水1 000.0 mL pH7.0 A.4.2 制法将上述成分溶解于蒸锚水中，调节pH，分装试管，每管1mL,12
16、1 .C高压灭菌15min，备用。A.4.3 甲基红(MR)试验A. 4. 3.1 甲基红试荆A. 4. 3. 1. 1 成分A.4.3.1.2 制法甲基红95%乙醇蒸馆水10 mg甲基红溶于30mL 95%乙醇中，然后加入20mL蒸馆水。A. 4. 3. 1. 3 试验方法10 mg 30.0 mL 20.0 mL 取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白陈水，36.C土1.C培养2d5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A. 4. 4 v-P试验A. 4. 4.1 6%荼酣-z.醇溶液成分及制法:取-荼酣6.0g，加无水乙醇溶解，定容至100mL。A.4.4.2
17、40%氢氧化饵溶液成分及制法z取氢氧化饵40g，加蒸锢水溶解，定容至100mL. A.4.4.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白陈水，36.C士1.C培养2d4d。加入6%a-荼酣-乙醇GB 4789.38-2012 溶液0.5mL和40%氢氧化饵溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36.C :f: 1 c继续培养4h再进行观察。A.5 西蒙氏拧棒酸盐培养基A. 5.1 成分A.5.2 制法拧攘酸铀氯化铀磷酸氢二饵磷酸二氢镀硫酸镜澳百里香酣蓝琼脂蒸馆水pH6. 8:f: 0. 2 2.0 g 5.0 g 1. 0g 1. 0g
18、 0.2 g 0.08 g 8. 0 g18. 0 g 1 000.0 mL 将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装10mL, 121 .C高压15min，制成斜面。A.5.3 试验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面，3 6 C:f: 1 c培养24h士2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。A.6 磷酸盐缓冲液A. 6.1 成分A.6.2 制法磷酸二氢饵(KHzP04)蒸悔水pH7.2 34.0 g 500.0 mL 贮存液z称取34.0g的磷酸二氢饵溶于500mL蒸馆水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化铀调节pH，用蒸馆水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。稀释液z取贮存液1.25
19、mL，用蒸馆水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121.C高压灭菌15 min。A.7 伊红美蓝(EMB)琼脂A. 7.1 成分8 蛋白陈乳糖磷酸氢二怦(KzHP04)10.0 g 10.0 g 2.0 g A.7.2 制法琼脂伊红y(水溶液)美蓝蒸馆水pH7.1土0.215.0 g 0.4 g或2.%水溶液20.0mL 0.065 g或0.5.%水溶液13.0mL 1 000.0 mL GB 4789.38-2012 在1000 mL蒸馆水中煮沸溶解蛋白陈、磷酸盐和琼脂，加水补足。分装于三角烧瓶中。每瓶100 mL或200mL，调节pH，121.C高压灭菌15mino使用前将琼脂融化，
20、于每100mL琼脂中加5 mL灭菌的20.%乳糖溶液，2mL的2.%的伊红Y水溶液和1.3mLO.5.%的美蓝水溶液，摇匀，冷至45 .C50 .C倾注平皿。A.8 营养琼脂斜面A. 8.1 成分A.8.2 制法牛肉膏蛋白陈琼脂蒸锢水pH7.3士O.1 3.0 g 5.0 g 15.0 g 1 000.0 mL 将上述成分加于蒸馆水中，煮沸溶解，调节pH。分装合适的试管，121.C高压灭菌15min.灭菌后摆成斜面备用。A.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)A. 9.1 成分蛋白陈7.0 g 酵母膏3.0 g 乳糖10.0 g 氯化铀5.0 g 胆盐或3号胆盐1. 5g 中性红0.03 g
21、结晶紫0.002 g 琼脂15 g18 g 蒸悟水1000.0 mL pH7.4:l: 0.1 A.9.2 制法将上述成分溶于蒸懵水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷至45.C 50.C倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。9 GB 4789.38-2012 A.10 结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酬-JJ-D-葡萄糖昔琼脂(VRBA-MUG)A. 10. 1 成分蛋白陈7.0 g 酵母膏3.0 g 乳糖10.0 g 氧化铀5.0 g 胆盐或3号胆盐1. 5g 中性红0.03 g 结晶紫0.002 g 琼脂15 g18 g 蒸锢水1 000.0 mL 4甲基伞形酣-
22、D-葡萄糖昔(MUG)0.1 g pH7.4土0.1A. 10.2 制法将上述成分溶于蒸馆水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pHo煮沸2min，将培养基冷至45OC 50 oc使用。A.11 草兰氏染色波A. 11. 1 结晶紫染色液A. 11. 1. 1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液A. 11. 1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙酶中，然后与草酸镀溶液混合。A. 11. 2 草兰氏破液A. 11.2. 1 成分A. 11. 2. 2 制法腆腆化伺蒸锢水1. 0g 20.0 mL 80.0 mL 1. 0g 2.0 g 300.0 mL 将腆与腆化饵先行混合，加入少许蒸锢水充分振摇，待完全
23、溶解后，再加蒸馆水至300mL。10 GB 4789.38-2012 A. 11.3 沙黄复染液A.11.3.1 成分A. 11. 3. 2 制法沙黄95%乙醇蒸馆水将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸锚水稀释。A. 11. 4 染色法A. 11. 4. 1 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。A. 11. 4. 2 滴加革兰氏腆液，作用1miIi，水洗。0.25 g 10.0 mL 90.0 mL A. 11.4.3 滴加95%乙醇脱色约15s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A. 11.4.4 滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.12 Kovacs蘸基质试
24、剂A. 12. 1 成分A. 12.2 制法对二甲氨基苯甲醒戊薛盐酸(浓)将对二甲氨基苯甲醒溶于戊障中，然后慢慢加入浓盐酸即可。A. 12.3 试验方法5.0 g 75.0 mL 25.0 mL 将培养物接种蛋白陈水，36c士1.C培养24h土2h后，加Kovacs蘸基质试剂o.2 mLO. 3 mL, 上层出现红色为蘸基质阳性反应。A.13 无菌1mol/L NaOH A. 13. 1 成分A. 13.2 制法NaOH 蒸馆水40.0 g 1 000.0 mL 称取40g氢氧化铀溶于1000mL蒸馆水中，121.C高压灭菌15min. 11 GB 4789.38-2012 A.14 无菌1m
25、ol/L HCI A. 14. 1 成分A. 14.2 制法HCl 蒸馆水90.0 mL 1 000.0 mL 移取浓盐酸90mL.用蒸锢水稀释至1000 mL.121 .C高压灭菌15miu o 12 GB 4789.38-2012 附录B大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表每g(mL)检样中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)的检索见表B.l。表B.1大肠埃希民菌最可能数(MPN)检索表阳性管数95%置信区间阳性管数95%置信区间MPN MPN o. 10 0.01 0.001 下限上限0.10 0.01 0.001 下限上限。1100 420 注，:本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.01
26、g(mL)和0.001g(mL汀，每个稀释接种3管。注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (mL)、0.001g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。13 N-ON|的.mh叮目。国华人民共和国家标准食品安全国家标准中食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数GB 4789. 38-2012 晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤印张1.25 字数27千字2012年7月第一次印刷开本880X12301/16 2012年7月第一版祷书号:155066. 1-45321 21.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB 4789.38-2012 打印日期:2012年7月24日F002
