1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验Microbiological examinati。nof food hygiene Examination 。rCampylobacter jejani 1 主题内容与适用范围本标准规定了空肠弯曲菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中空肠弯曲菌的检验。2 引用标准GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3. 1 温箱，42土1。3. 2 厌氧罐带有双相压力表。3.3气袋法。3.4 无菌平皿。3. 5 灭菌吸管。3.6相差显微镜。3. 7三角瓶。3.8玻片染色缸或染色盘。3.9载玻片e3. 10液
2、氮罐。3. 11 厚壁毛细管。3. 12 水浴器，25土1，37士l和42土1各一台。3. 13酒精灯。3. 14 灭菌试管。3. 15接种针。3. 16试管架。4培弊基和试剂4. 1 蛋白陈水按GB4789. 28中3.13规定。4. 2 Cary Blair氏运送培养基s按GB4789. 28中4.52规定。4. 3 改良Camp-BAP培养基z按GB4789. 28中4.53规定。4. 4 Skirrow氏培养基z按GB4789. 28中4.54规定。中华人民共和国卫生部199403-18批准GB 4789. 9-94 代替GB4789. 9 84 1994 09 01实施185 GB
3、4 7 8 9. 9-9 4 4. 5 氧化酶试:lf!J按GB4789. 28中3.18规定。4. 6 3%过氧化氢液z按GB4789. 28中3.20规定。4. 7 1%甘氨酸培养基z按GB4789. 28中4.56规定。4.8 30用茶晓酸圆形滤纸片。4.9三糖铁培养基z按GB4789. 28中4.26规定。4. 10 革兰氏染色液z按GB4789. 28中2.2规定。4. 11 TTC琼脂g按GB4789. 28中4.55规定。4. 12 马尿酸纳培养基z按GB4789. 28中3.9规定。4. 13三氯化铁g按GB4789. 28中3.9规定。4. 14 快速硫化氢（凡S）试验琼脂g
4、按GB4789. 28中4.50规定。4. 15 DNA酶甲基绿琼脂z按GB4789. 28中4.51规定。5检验程序空肠弯曲菌检验程序如下：186 GB 4789. 9 94 样检改良CmJ-BAP 布氏抨菌培基42C ,4胁，徽需氧革兰氏挠包动力试验氧化酶试验过氧化氢酶试验直接相量镜栓辑种血琼扁平极42，48h，徽需氧T 试验蔬幢酸试挫硝酸盐还原试验马尿酸铺水解试验生茸温度试验4 MW辄化铺试瞌3 硫tz试磕山川甘组酸试验告报操作步骤6 6. 1 样品的采集及处理不论那种食物样品都应尽快交付检验。如果样品必须运送和保存，应当使用CaryBlair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在
5、25情况下，其存活时间不到24h或更少，因此样品在原始分离前需放冰箱或冷处保存。6. 2微需氧条件的制备最佳微需氧条件是氧气为5%、二氧化碳为10%、氮气为85%。6. 2. 1 带有双相压力计可表示正负压的的厌氧罐s在装皿密封后，先抽去罐内空气至负压7.3 lOPa (550 mmHg）处，输入上述三种混合气体使罐内压力恢复于零s再将罐内气体抽至负压187 GB 4789. 9-94 7. 3 10Pa(550 tnmHg），同样输入上述气体至零，即可放置温箱培养。6. 2. 2 气袋法：操作时只使用气体发生剂而不加催化剂。6. 2. 3双平板法z取两块平板，一块平板接种已知的兼性庆氧菌如变
6、形杆菌，另一块平板接种样品，去掉皿盖，将含琼脂的两只皿相对合齐并用胶布粘封，放入密封不漏气的罐内（或袋内）进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用，可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。6.2.4蜡烛缸法将已接种细菌的平板置于容量2ooo mL的磨口标本缸或干燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林，放入小段点燃蜡烛于缸内勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂，盖密缸盖。缸内燃1烛约于0.5 l min，因氧减少自行熄灭，此时容器内约含二氧化碳5%10%。最后连同容器一并置于42士1温箱中培养。6. 3分离培养6. 3. 1 拭子或液体可直接在选择性培养基如改良Camp卢BAP布氏杆菌培养基或使用Skirr
7、ow氏培养基平板上划线接种。于42培养48h后，观察可疑菌落。6. 3. 2 第一型菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，有从接种线向外扩散的倾向B第二型菌落也不榕血，常呈分散凸起的单个菌落直径为12mm），边缘完整、发亮。6.4 初步鉴定将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染色。本菌为革兰氏阴性酶，大小为0.30.4mXl.53m，呈S形、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不远条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察，动力明显。根据菌落生长特征、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性者，可初步确定为弯曲菌。6.5确定鉴定经初步鉴定
8、后，仍需做下述试验（以下各项试验均需在5%氧气的微需氧环绕中培养）。6. 5. 1 甘氨酸、lycine）耐受性试验g接种于甘氨酸培养基中，培养48h，如为阳性，在培养基表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种6.5.2硫化氢生长试验z接种于TSI斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸条子管口，培养物经4872h培养，空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性碱性（K/K），滤纸条变黑，但培养基底部不因硫化氢而变黑。6. 5. 3 对3.5%氯化纳的耐受性试验z接种于3.5%含盐肉汤培养基，经48h培养，空肠弯曲商不生长。6. 5. 4 42和25生长试验s将培养物接种于两管布氏杆菌肉汤中，管放于42下，一
9、管放于25下培养48h .42生长而25不生长者，则为空肠弯曲菌。6. 5. 5 马尿酸销水解试验z将培养物接种于马尿酸销培养基，于42培养48h，离心沉淀取出部分上清液。加入三氯化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。6. 5. 6 荼睫酸（Nalidixicacid）试验z将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上，然后贴上含30问荼睫酸的滤纸于平板上，空肠弯曲敏感而肠道弯曲菌不敏感6.5.7 TTC(2,3,5氯化三苯四氮瞠）试验z空肠弯曲菌在TTC培养基上呈阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者有紫色菌苔并有光泽。6. 5. 8硝酸盐还原试验s取培养物的浓菌悬液，在37放置2h,i
10、JO入试剂，观察颜色反应，空肠弯曲菌呈红色的阳性反应。6. 5. 弯曲菌的生化鉴别见表10 188 GB 4 789. 9-94 表1弯曲菌属各个种的生化性状胎儿弯曲菌痰弯曲菌项目粪弯曲菌胎儿亚种结踊亚种空肠亚种痰亚种牛亚种过氧化氢酶+ + + + 氧化酶十+ + + + 十！%甘氨酸试碰十+ + 十+ 十硫化氢试验（纸矗法十+ 十+ + 3. 5%氟化铺耐受试+ d 25生+ 十d 42生长十+ d ? 硝酸盐还原试验+ 十+ + + d 秦晓酸试验+ ? d TTC试验+ 十马尿酸倒水解十注+ 90%和90%以上阳性，d有的阴性，有的阳性，一一般不生长，90%和90%以上阴性11未知6.6
11、 生物分型6. 6. 1 快速马尿酸纳水解试验g将细菌接种在1%马尿酸纳0.4mL,37水泊Zh，再加丙商与了翻溶液的3.5%甜三嗣o.2 rnL，徐徐加入避免相混，放置10rnin后观察结果。深紫色为阳性，谈紫色或无色为阴性。6. 6. 2 快速硫化氢（矶S）试验s取一环细菌悬浮于快速硫化氨半固体琼脂上1/3段，37水浴Zh，观察结果，细菌团块周围变黑为阳性。6. 6. 3 DNA酶水解试验g细菌点种于DNA酶甲基绿琼脂平板上，微需氧环境培养35d，菌苔周围出现无色透明环为阳性。生物分型结果见表26. 7 血清分型z空肠弯曲菌。因子分型应采用间接血凝法，H或K因子分型可用玻片凝集法。表2空肠
12、弯曲菌等的生物分型生物型试验空肠弯曲菌弯曲菌嘈热弯曲菌I I IV I I 快速马原酸铺试验十十+ 十快速硫化氢试验十+ 十十DNA酶水解+ + + + 6.8菌种保存空肠弯曲茵茵种应接种在改良Camp-BAP斜面培养基上棉塞不宜过紧），于4243微需氧中培养48h后，置4冰箱微需氧内可保存1014d，需要时仍可转种一次，长期保存用冻干法。6.9对空肠弯曲菌检验时，应严格执行无茵操作，防止自身感染189 GB 4789. 9-94 附加说明g本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由中国迸出口商品检验技术研究所负责起草本标准主要起草人孟洪德。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。190
