1、gB ICS 65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准G/T 20444-2006 猪组织中四环素族抗生素残留量检测方法微生物学检测方法Method for the determination of tetracycline antibiotics in swine tissue-Microbiological method | . . E |: mmmma H们们们们们们川川nUUMM山川nut-EEnU HHHHHHHAU 啤闹呻啤啤啤啤啤咱A哇配配配配配EEEE-EEEE-今中HHHHHHH1IA t-EE- ，户。川川川川川川HHHnu- . Ea- 2006-11-01实
2、施2006-08-28发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会中华人民共和国国家标准猪组织中四环素族抗生素残留量检测方法微生物学检测方法GB/T 20444一20064晤中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里洞北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数8千字2006年11月第一版2006年11月第一次印刷* 书号:155066 1-28259 定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)685335
3、33前言本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位z农业部畜禽产品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人z李卫东、吴银良、李艳华。GB/T 20444-2006 I 1 范围猪组织中四环素族抗生素残留量检测方法微生物学检测方法G/T 20444-2006 本标准规定了猪组织中四环素族(四环素、金霉素、土霉素、强力霉素)残留量的检测方法。本标准适用于猪组织中四环素族(四环素、金霉素、土霉素、强力霉素)残留量的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本
4、标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格及试验方法3 制样3. 1 样晶的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，搅碎并使均匀。3.2 样晶的保存样品在一200C冰箱中贮存备用。4 测定方法4. 1 方法原理四环素族抗生素具有很强的抑菌作用，在含有特定微生物的平板培养基上放入牛津杯，在牛津杯内加满四环素族(包括强力霉素、四环素、全霉素、土霉素)抗生素溶液，于培养箱中培养一定时间后，测量抑菌圈直径的大小，根据抑菌圈的大小从标准曲线上求得样品中四环素族抗生素的含量。4.2 仪器和设备4.2.1 恒温培养
5、箱:300C:l:IOC、370C:l:IOC，调整水平位置(隔层要求水平)。4.2.2 高压灭菌锅。4.2.3 恒温水浴锅。4.2.4 培养皿(塑料):内径90mm士0.5mm，高26mm，JIIl底平整光滑，厚薄均匀无凹凸现象。4.2.5 陶瓦盖z内径110mm，外径116mm，高26mmo 4.2.6 离心机:3000 r/min5 000 r/min。4.2.7 均质器或组织捣碎机。4.2.8 牛津杯(即不锈钢小管):内径6mm:l: O. 1 mm，外径7.8mm:l: O. 1 mm，高度1刊omm土0.1mr丑nm口1。4.2.9 游标卡尺:测量抑菌圈直径用，精密度0.0仍5mr
6、旧I口m4.2.10 水平仪。4.2. 11 克氏瓶。4.3 试剂和材料4.3. 1 培养基4.3. 1. 1 菌种培养基GB/T 20444-2006 膜蛋白陈牛肉膏氯化纳琼脂蒸馆水10. 0 g 5.0 g 2. 5 g 14 g16 g 1 000 mL 将各种成分加热溶解于蒸馆水中，调pH至6.5，高压灭菌(121.C，15min)。4.3. 1. 2 检定培养基膜蛋白陈6. 0 g 牛肉膏酵母膏琼脂蒸馆水4. 3. 2 试剂4. 3. 2. 1 O. 1 mol/L 锢水中，转移到100 4.3. 3 菌种蜡样芽抱杆4.3. 4 标准晶4.3.5 标准晶中，可使用7天。4.3.5.2
7、 工作液取上述贮备液(包O. 100g/mL，0.200g/ 1. 5g 、.、111O. 100g/mL的稀释液为参啕妇雯溶金霉素稀释液:取上述原可O. 100g/mL，0.200g/mL，0.400 的稀释液为参考浓度溶液。.1 mol/L盐酸溶制成O.050g/mL， 示准曲线的标准浓度溶液. 005g/mL， O. 050g/mL， 曲线的标准浓度溶液O.100g/mL 实验室用水应符合GB/T6682中三级水的规格，本方法中所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯。4. 4 测定步骤4.4.1 菌悬液的制备将蜡样芽子包杆菌接种于肉汤培养基中于37.C士1.C培养6h8 h后，接种于菌种培养
8、基上30.C土rc培养7d，用25mL灭菌生理盐水冲洗菌苔，恒温水浴65.C土1.C加热30min，以2000r/min的速度离心20min，除去上清液，保留下层，重复三次洗涤芽抱悬液，然后用50mL灭菌生理盐水制成芽抱悬液，放置4.C冰箱保存备用，可放置2个月。GB/T 20444-2006 4.4.2 芽抱悬液用量的测定先试几个平板，即把不同浓度的芽抱悬液加入检定用的培养基中使各标准品工作放度中最小浓度的四环素族抗生素产生12mm以上的清晰、完整的抑菌圈而获得最适宜芽抱悬液用量。一般用量为每100 mL检定用培养基内加0.5mL至1.0 mL或芽抱计数后使1.0 mL菌液含芽抱数约106个
9、。4.4.3 检定用平顿的制备将适量芽抱悬液加到熔化后冷却至55.C60.C的检定培养基中混匀，每个平皿内加入6mL.前后摇动平皿，使含有芽抱的检定培养基均匀覆盖于平皿表面，置水平位置，盖上陶瓷盖，待凝固后，每个平板的培养基表面放置6个小管，使小管在半径为2.8cm的圆面上成60。角的间距，所用平板须当天制备。4.4.4 样晶制备取样品约20g左右剪碎，称取其中10.0g加入0.1mol!L磷酸盐缓冲液10.0mL.小心搅匀，放置60 min.置灭菌的均质杯中(9000 r/min 10 000 r/min)均质2min(或置灭菌的乳钵内研磨成乳康状).经4000r/min离心30min.其上
10、清液作为被检样液。4.4.5 标准曲线的制备取上述各标准品工作液和O.100g/mL的标准榕液为参照浓度工作液按微生物琼脂扩散法测定各浓度的抑菌圈直径，其中最低标准品工作浓度作为阴性结果的平板对照，其他标准品工作浓度按式(1)和式(2)计算后用来绘制标准曲线zL= (3a+2b+c-e)/5 D = (3e+2d+c-a)/5 、，、，/1i叮Lr，、/，、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 式中zL-一标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径(四环素、强力霉素、土霉素为0.050/-(g/mL.金霉素为0.00 5g/mL
11、) ; D一一一标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径(四环素、强力霉素、土霉素为O.800g/mL.金霉素为0.005g/mL) ; c-一参照浓度O.100g/mL的所有抑菌圈直径的平均值;a，b、d、e一一标准曲线中其他标准浓度的抑菌圈直径经校准后的平均值。然后根据计算所得的L和D作为横坐标.L和D对应的浓度的对数值作为纵坐标，绘制标准曲线。4.4.6 样晶测定每个样品取3个检定平板，每个检定平板放入6个牛津杯。将3个间隔的牛津杯中注满被检样液。另3个牛津杯中注满O.100g/mL标准液。将培养皿小心轻放入30.C士1.C恒温箱中.17h土1h培养。培养后用游标卡尺测量抑菌圈内直径(精确到0.1
12、mm).并分别求出平均值，经校正后，从标准曲线查出被检样液中四环素、强力霉素、金毒素、土霉素的含量，再乘以稀释倍数。4.4.7 空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4.5 结果计算和表述供试组织中四环素族抗生素残留含量按式(3)计算:x= cXV/m . ( 3 ) 式中:X一-供试组织中四环素族抗生素含量，单位为毫克每千克(mg/kg); C一-供试试料试样溶液中四环素族抗生素浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V一一供试试料试样榕液总体积，单位为毫升(mL);m一-供试试料质量，单位为克(g)。CON-叮叮叮ONH筒。GB/T 20444-2006 检测方法灵敏度、准确度、精密度灵敏度本方法的检测限其中四环素、土霉素、强力霉素为0.05mg/kg，金霉素为0.01mg/kg o 5.2 准确度本方法中各四环素族抗生素在各浓度水平下回收率均在60%1l0%范围内。5.3 精密度本方法的批内误差小于10%，批间误差小于15%。5 5. 1 侵权必究书号:155066 1-28259 定价z8.00元陡版权专有GB/T 20444-2006
