1、GB/T 3543.51995 1 主题内容与适用范围 本标准规定了测定种子真实性和品种纯度的方法。 本标准适用于农作物种子质量的检测。 2 引用标准 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 3 术语 3.1 种子真实性 genuineness of seed 供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。 3.2 品种纯度 varietal purity 品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。 3.3 变异株 off-type 一个或多个性状(特征特性)与原品种育成者所描述的性状明显不同
2、的植株。 3.4 育种家种子 breeder seed 育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子，用于进一步繁殖原种种子。 3.5 原种 basic seed 用育种家种子繁殖的第一代至第三代，或按原种生产技术规程生产的达到原种质量标准的种子，用于进一步繁殖良种种子。 3.6 良种 certified seed 用常规种原种繁殖的第一代至第三代和杂交种达到良种质量标准的种子，用于大田生产。 4 试剂 苯酚、愈创木酚、过氧化氢、氢氧化钾、氢氧化钠、氯化氢。 5 仪器和设备 其仪器设备也随方法的差异而不同。 页码，1/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C
3、:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm a. 在实验室中测定 配备适宜的仪器(如体视显微镜、扩大镜、解剖镜)与试剂，以供种子形态、生理及细胞学的检查、化学测定及种子发芽之用。 b. 在温室和培养室中测定 配备能调节环境条件的设备(如生长箱)，以利诱导鉴别性状的发育。 c. 在田间小区里鉴定 需具有能使鉴定性状正常发育的气候、土壤及栽培条件，并对防治病虫害有相对的保护措施。 6 测定程序 6.1 送验样品的重量 品种纯度测定的送验样品的最小重量应符合表1的规定。 表 1 品种纯度测定的送验样品重量 6.2 种子鉴定 6.2.1 形态鉴定法 随机从送验样品中数取400
4、粒种子，鉴定时须设重复，每个重复不超过100粒种子。 根据种子的形态特征，必要时可借助扩大镜等进行逐粒观察，必须备有标准样品或鉴定图片和有关资料。 水稻种子根据谷粒形状、长宽比、大小、稃壳和稃尖色、稃毛长短、稀密、柱头夹持率等；大麦种子根据籽粒形状、外稃基部皱褶、籽粒颜色、腹沟基刺、腹沟展开程度、外稃侧种 类 限于实验室测定 田间小区及实验室测定豌豆属、菜豆属、蚕豆属、玉米属、大豆属及种子大小类似的其他属 1 000 2 000水稻属、大麦属、燕麦属、小麦属、黑麦属及种子大小类似的其他属 500 1 000甜菜属及种子大小类似的其他属 250 500所有其他属 100 250页码，2/10GB
5、/T 3543.519952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm背脉纹齿状物及脉色、外稃基部稃壳皱褶凹陷、小穗轴茸毛多少、鳞被(浆片)形状及茸毛稀密等；大豆种子可根据种子大小、形状、颜色、光泽、光滑度、蜡粉多少及种脐形状颜色等；葱类可根据种子大小、形状、颜色、表面构造及脐部特征等。 6.2.2 快速测定法 随机从送验样品中数取400粒种子，鉴定时须设重复，每个重复不超过100粒种子。 a. 苯酚染色法 小麦、大麦、燕麦：将种子浸入清水中经1824h，用滤纸吸干表面水分，放入垫有已经1苯酚溶液湿润滤纸的培养皿内(腹沟朝下)。在室温下，
6、小麦保持4h，燕麦2h，大麦24h后即可鉴定染色深浅。小麦观察颖果染色情况，大麦、燕麦评价种子内外稃染色情况。通常颜色分为五级即浅色、淡褐色、褐色、深褐色和黑色。将与基本颜色不同的种子取出作为异品种。 水稻：将种子浸入清水中经6h，倒去清水，注入1( m/V)苯酚溶液，室温下浸12h取出用清水洗涤，放在滤纸上经24h，观察谷粒或米粒染色程度。谷粒染色分为不染色、淡茶褐色、茶褐色、黑褐色和黑色五级；米粒染色分不染色、淡茶褐色、褐色或紫色三级。 b. 大豆种皮愈创木酚染色法 将每粒大豆种子的种皮剥下，分别放入小试管内，然后注入1mL蒸馏水，在30下浸提1h，再在每支试管中加入10滴0.5愈创木酚溶
7、液，10min后，每支试管加入1滴0.1过氧化氢溶液。1min后，计数试管内种皮浸出液呈现红棕色的种子数与浸出液呈无色的种子数。 c. 高粱种子氢氧化钾漂白粉测定法 配制1：5( m/V)氢氧化钾和新鲜普通漂白粉(5.25漂白粉)的混合液即1g氢氧化钾(KOH)加入5.0mL漂白液，通常准备100mL溶液，贮于冰箱中备用。将种子放入培养皿内，加入氢氧化钾漂白液(测定前应置于室温一段时间) 以淹没种子为度。棕色种皮浸泡10min。浸泡中定时轻轻摇晃使溶液与种子良好接触，然后把种子倒在纱网上，用自来水慢慢冲洗，冲洗后把种子放在纸上让其气干，待种子干燥后，记录黑色种子数与浅色种子数。 d. 燕麦种子
8、荧光测定法 应用波长360A紫外光照射，在暗室内鉴定。将种子排列在黑纸上，置于距紫外光下1015cm处，照射数秒至数分钟后即可根据内外稃有无荧光发出进行鉴定。 e. 燕麦种子氯化氢测定法 将燕麦种子放入早已配好的氯化氢溶液1份38( V/V)盐酸(HCI)和4份水的玻璃器皿中浸泡6h，然后取出放在滤纸上让其气干1h。根据棕褐色(荧光种子)或 黄色(非荧光种子)来鉴别种子。 f. 小麦种子的氢氧化钠测定法 当小麦种子红白皮不易区分(尤其是经杀菌剂处理的种子)时，可用氢氧化钠测定法加以区别。数取400粒或更多的种子，先用95( V/V)甲醇浸泡15min，然后让种子干燥30min，在室温下将种子浸
9、泡在5M/LNaOH溶液中5min，然后将种子移至培养皿内，不可加盖，让其在室温下干燥，根据种子浅色和深色加以计数。 页码，3/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm6.2.3 小麦、大麦醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳法见附录A(参考件)。 6.3 幼苗鉴别 随机从送验样品中数取400粒种子，鉴定时须设重复，每重复为100粒种子。在培养室或温室中，可以用100粒，二次重复。 幼苗鉴定可以通过两个主要途径：一种途径是提供给植株以加速发育的条件(类似于田间小区鉴定，只是所需时间较短)，当幼苗达到适宜评价的
10、发育阶段时，对全部或部分幼苗进行鉴定；另一种途径是让植株生长在特殊的逆境条件下，测定不同品种对逆境的不同反应来鉴别不同品种。 禾谷类：禾谷类作物的芽鞘、中胚轴有紫色与绿色两大类，它们是受遗传基因控制的。将种子播在砂中(玉米、高粱种子间隔1.0cm4.5cm，燕麦、小麦种子间隔2.0cm4.0cm，播种深度1.0cm)，在25恒温下培养，24h光照。玉米、高粱每天加水，小麦、燕麦每隔4d施加缺磷的Hoagland 1号培养液，在幼苗发育到适宜阶段时，高粱、玉米14d，小麦7d，燕麦1014d，鉴定芽鞘的颜色。 注：缺磷的Hoagland 1号培养液配方：在1L蒸馏水中加入4mLM/L硝酸钙溶液C
11、a(NO3)2、2mL1 M/L硫酸镁溶液（MgSO4)和6mL 1 M/L硝酸钾溶液(KNO3)。 大豆：把种子播于砂中(种子间隔2.5cm2.5cm，播种深度2.5cm)，在25下培养，24h光照，每隔4d施加Hoagland 1号培养液，至幼苗各种特征表现明显时，根据幼苗下胚轴颜色(生长1014d)、茸毛颜色(21d)、茸毛在胚轴上着生的角度(21d)、小叶形状(21d)等进行鉴定。 注：Hoagland1号培养液配方：在1L蒸馏水中加入1mL 1M/L磷酸二氢钾溶液（KH2PO4)、5mL1 M/L硝酸钾溶液(KNO3)、5mL1 M/L硝酸钙溶液Ca(NO3)2 和2mL 1M/L硫
12、酸镁溶液(MgSO4)。 莴苣：将莴苣种子播在砂中(种子间隔1.0cm4.0cm，播种深度1cm)，在25恒温下培养，每隔4d施加Hoagland1号培养液，3周后(长有34片叶)根据下胚轴颜色、叶色、叶片卷曲程度和子叶等形状进行鉴别。 甜菜：有些栽培品种可根据幼苗颜色(白色、黄色、暗红色或红色)来区别。将种球播在培养皿湿砂上，置于温室的柔和日光下，经7d后，检查幼苗下胚轴的颜色。根据白色与暗红色幼苗的比例，可在一定程度上表明糖用甜菜及白色饲料甜菜栽培品种的真实性。 6.4 田间小区种植鉴定1)田间小区种植是鉴定品种真实性和测定品种纯度的最为可靠、准确的方法。为了鉴定品种真实性，应在鉴定的各个
13、阶段与标准样品进行比较。对照的标准样品为栽培品种提供全面的、系统的品种特征特性的现实描述，标准样品应代表品种原有的特征特性，最好是育种家种子。标准样品的数量应足够多，以便能持续使用多年，并在低温干燥条件下贮藏，更换时最好从育种家处获取。 注：1)本节等效采用国际贸易中种子流通的OECD品种认证方案小区鉴定方法指南(OECD1982)。 为使品种特征特性充分表现，试验的设计和布局上要选择气候环境条件适宜的、土壤均匀、肥力一致、前茬无同类作物和杂草的田块，并有适宜的栽培管理措施。 页码，4/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C:Inetpubwwwrootdatagb
14、nN3543E0A.htm 行间及株间应有足够的距离，大株作物可适当增加行株距，必要时可用点播和点栽。 为了测定品种纯度百分率，必须与现行发布实施的国家标准种子质量标准相联系起来。试验设计的种植株数要根据国家标准种子质量标准的要求而定，一般来说，若标准为( N-1)100 /N，种植株数4N即可获得满意结果，如标准规定纯度为98，即N为50，种植200株即可达到要求。 检验员应拥有丰富的经验，熟悉被检品种的特征特性，能正确判别植株是属于本品种还是变异株。变异株应是遗传变异，而不是受环境影响所引起的变异。 许多种在幼苗期就有可能鉴别出品种真实性和纯度，但成熟期(常规种)、花期(杂交种)和食用器官
15、成熟期(蔬菜种)是品种特征特性表现时期，必须进行鉴定。 良种品种纯度是否达到国家标准种子质量标准、合同和标签的要求，可利用表2进行判别。 表 2 品种纯度的容许差距 (5显著水平的一尾测定) 标准规定值 样本株数、苗数或种子粒数 50以上 50以下50 75 100 150 200 400 600 1000100 99 98 97 96 0 1 2 3 4 0 2.3 3.3 4.0 4.6 0 1.9 2.7 3.3 3.7 0 1.6 2.3 2.8 3.2 0 1.3 1.9 2.3 2.6 0 1.2 1.6 2.0 2.3 0 0.8 1.2 1.4 1.6 0 0.7 0.9 1.
16、2 1.3 0 0.5 0.7 0.9 1.0 95 94 93 92 91 5 6 7 8 9 5.1 5.5 6.0 6.3 6.7 4.2 4.5 4.9 5.2 5.5 3.6 3.9 4.2 4.5 4.7 2.9 3.2 3.4 3.7 3.9 2.5 2.8 3.0 3.2 3.3 1.8 2.0 2.1 2.2 2.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 90 89 88 10 11 12 7.0 7.3 7.6 5.7 6.0 6.2 5.0 5.2 5.4 4.0 4.2 4.4 3.5 3.7 3.8 2.5 2.6 2.7 2
17、.0 2.1 2.2 1.6 1.6 1.7 页码，5/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm87 86 13 14 7.9 8.1 6.4 6.6 5.5 5.7 4.5 4.7 3.9 4.0 2.8 2.9 2.3 2.3 1.8 1.8 85 84 83 82 81 15 16 17 18 19 8.3 8.6 8.8 9.0 9.2 6.8 7.0 7.2 7.3 7.5 5.9 6.1 6.2 6.3 6.5 4.8 4.9 5.1 5.2 5.3 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6
18、 3.0 3.0 3.1 3.2 3.2 2.4 2.5 2.5 2.6 2.6 1.9 1.9 2.0 2.0 2.1 80 79 78 77 76 20 21 22 23 24 9.3 9.5 9.7 9.8 10.0 7.6 7.8 7.9 8.0 8.1 6.6 6.7 6.8 7.0 7.1 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 4.7 4.8 4.8 4.9 5.0 3.3 3.4 3.4 3.5 3.5 2.7 2.7 2.8 2.8 2.9 2.1 2.1 2.2 2.2 2.2 75 74 73 72 71 25 26 27 28 29 10.1 10.2 10.4 10.
19、5 10.6 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 5.8 5.9 6.0 6.1 6.1 5.1 5.1 5.2 5.2 5.3 3.6 3.6 3.7 3.7 3.8 2.9 3.0 3.0 3.0 3.1 2.3 2.3 2.3 2.3 2.4 70 69 68 67 66 30 31 32 33 34 10.7 10.8 10.9 11.0 11.1 8.7 8.8 8.9 9.0 9.0 7.6 7.6 7.7 7.8 7.8 6.2 6.2 6.3 6.3 6.4 5.4 5.4 5.5 5.5 5.5 3.8 3.8 3.8 3.9 3.
20、9 3.1 3.1 3.2 3.2 3.2 2.4 2.4 2.4 2.5 2.5 65 64 63 62 61 35 36 37 38 39 11.1 11.2 11.3 11.3 11.4 9.1 9.1 9.2 9.2 9.3 7.9 7.9 8.0 8.0 8.1 6.4 6.5 6.5 6.5 6.6 5.6 5.6 5.6 5.7 5.7 3.9 4.0 4.0 4.0 4.0 3.2 3.2 3.3 3.3 3.3 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 60 40 11.4 9.3 8.1 6.6 5.7 4.0 3.3 2.6 页码，6/10GB/T 3543.5199520
21、06-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm 国家标准种子质量标准规定纯度要求很高的种子，如育种家种子、原种，是否符合要求，可利用淘汰值。淘汰值是在考虑种子生产者利益和有较少可能判定失误的基础上，把在一个样本内观察到的变异株数与质量标准比较，作出接受符合要求的种子批或淘汰该种子批，其可靠程度与样本大小密切相关(见表3)。 表 3 不同样本大小符合标准99.9接收含有变异株种子批的可靠程度 注：1)是指每1000株中所实测到的变异株。 不同规定标准与不同样本大小下的淘汰值见表4，如果变异株大于或等于规定的淘汰值，就应淘汰该种子批。 表 4 不同
22、规定标准与不同样本大小的淘汰值 59 58 57 56 41 42 43 44 11.5 11.5 11.6 11.6 9.4 9.4 9.4 9.5 8.1 8.2 8.2 8.2 6.6 6.7 6.7 6.7 5.7 5.8 5.8 5.8 4.1 4.1 4.1 4.1 3.3 3.3 3.3 3.4 2.6 2.6 2.6 2.6 55 54 53 52 51 50 45 46 47 48 49 11.6 11.6 11.6 11.7 11.7 11.7 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 8.2 8.2 8.2 8.3 8.3 8.3 6.7 6.7 6.7 6.7 6
23、.7 6.7 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 样本大小 (株数) 淘汰值接受种子批的可靠程度，1.5/10001)2/10001)3/10001)1000 4000 8000 12000 4 9 14 19 93 85 68 56 85 59 27 13 65 16 1 0.1 规定标准 不同样本（株数）大小的淘汰值 4000 2000 1400 1000 400 300 200页码，7/10GB/T 3543.519952006-3-
24、29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm 注：下方有“”的数字或“”均表示样本的数目太少。 7 结果计算和表示 7.1 种子和幼苗 用种子或幼苗鉴定时，用本品种纯度百分率表示。 品种纯度()=供检种子粒数(幼苗数)-异品种种子粒数(幼苗数)/供检种子粒数(幼苗数)100 7.2 田间小区鉴定 将所鉴定的本品种、异品种、异作物和杂草等均以所鉴定植株的百分率表示。 8 结果报告 在实验室、培养室所测定的结果须填报种子数、幼苗数或植株数。 田间小区种植鉴定结果除品种纯度外，可能时还填报所发现的异作物、杂草和其他栽培品种的百分率。 附 录 A 聚丙烯酰胺电
25、泳法测定大麦、小麦种子纯度 (参考件) A1 原理 从种子中提取的醇溶蛋白在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种由于遗传组成不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对品种真实性和纯度进行鉴定。 A2 仪器和试剂 A2.1 仪器 电泳仪(满足稳压500V)，离心机，垂直板电泳槽，钳子，5mL、10mL移液管，微量进样器，聚丙烯离心管。 A2.2 试剂 尿素、乙醇、甘氨酸、甲基绿、三氯乙酸、冰乙酸、过氧化氢、硫酸亚铁、抗坏血酸、-巯基乙醇、丙烯酰胺、考马斯亮蓝R250，甲叉双丙烯酰胺、 氯乙醇。 99.9 9
26、9.7 99.0 9 19 52 6 11 29 5 9 21 4 7 16 4 9 7 6 页码，8/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htmA3 程序 A3.1 药剂配制 A3.1.1 蛋白质提取液 小麦：0.05g甲基绿溶于25mL 氯乙醇中，加蒸馏水至100mL。低温保存。 大麦：0.05g甲基绿溶于20mL -氯乙醇中，加入18g尿素，再加入1mL - 巯基乙醇，加蒸馏水至100mL。低温保存。 A3.1.2 电极缓冲液 0.4g甘氨酸加蒸馏水溶解，加4mL冰乙酸，加蒸馏水至1000mL。低
27、温保存。 A3.1.3 凝胶缓冲液 1.0g甘氨酸加蒸馏水溶解，加入20mL冰乙酸，定容至1000mL。低温保存。 A3.1.4 0.6过氧化氢 30过氧化氢2mL加蒸馏水定容至100mL。低温保存。 A3.1.5 染色液 0.25g考马斯亮蓝加25mL，无水乙醇溶解，加入50g三氯乙酸，加水至500mL。 A3.1.6 凝胶液 丙烯酰胺20g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，尿素12g，硫酸亚铁0.01g，抗坏血酸0.2g，用凝胶缓冲液溶解并定容至200mL。低温保存。 A3.2 样品提取 一般每个样品测定100粒种子，若更准确地估测品种纯度，则需更多的种子。如果分析结果要与某一纯度标准值比较，可采
28、用顺次测定法(sequential testing) 来确定，即50粒作为一组，必要时可连续测定数组，以减少工作量。如果只鉴定真实性，可用50粒。 取小麦或大麦种子，用钳子逐粒夹碎(夹种子时，最好垫上小片清洁的纸，以便于清理钳头和防止样品之间的污染)，置1.5mL离心管中，加入蛋白质提取液(小麦0.2mL，大麦0.3mL)，充分摇动混合，在室温下提取24h，然后在18000g条件下离心15min。取其上清液用于电泳。 A3.3 凝胶制备 从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢溶液，吸取10mL凝胶溶液，加1滴0.6过氧化氢，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶液，让其在510min 聚合封
29、好。 吸取45mL凝胶溶液，加3滴0.6过氧化氢，迅速摇匀，倒入凝胶板之间，马上插好样品梳，让其在510min内聚合。 A3.4 进样 页码，9/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm 小心抽出样品梳，将玻璃板夹在电泳槽上，用滤纸或注射器吸去样品槽中多余的水分，然后用微量进样器吸取1020 L样品加入样品槽中。 A3.5 电泳 在前后槽注入电极液，前槽接正极，后槽接负极。然后打开电源，逐渐将电压增加到500V。电泳时，要求在1520温度下进行。电泳时间一般为6080min，具体时间可按甲基绿迁移时间来推算，电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的22.5倍。 A3.6 染色 将胶板小心地取下，在染色液中染色12d。一般情况不需要脱色，但为使谱带清晰，可用清水冲洗。 A3.7 鉴定 谱带命名可采用相对迁移率法或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性，并与标准样品电泳图谱相比较，鉴定种子真实性以及测定品种纯度。 页码，10/10GB/T 3543.519952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbnN3543E0A.htm
