1、ICS 67，040C 53 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 5009206-2007鲜河豚鱼中河豚毒素的测定2007-10-29发布Determination of tetrodotoxin in fresh pufferfish2008-040 1实施,中tl黼戮粪发布国国家标准化管理委员会促19刖 昌本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：计融、李凤琴、王健伟、罗雪云、江涛、韩春卉、张靖。GBT 5009206-2007鲜河豚鱼中河豚毒素的测定GBT 500920620071范围本标准规定了鲜河豚鱼中河豚毒素(te
2、trodotoxin，简写为TTX)的测定方法。本标准适用于鲜河豚鱼中TTX的测定。本标准对TTX的检出限为01 vtgL，相当于样品中1 pgkg的TTX，标准曲线线性范围为5 pgL500 pgL。2原理样品中的河豚毒素经提取、脱脂后与定量的特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入底物后显色，与标准曲线比较来测定TTX含量。3试剂除TTX标准品外，实验所用的化学试剂均为分析纯。31抗河豚毒素单克隆抗体：杂交瘤技术生产并经纯化的抗TTX单克隆抗体。32牛血清白蛋白(BSA)。33人工抗原：牛血清白蛋白一甲醛一河豚毒素连接物(BsA_HcHDTTx)，一20*(2
3、保存，冷冻干燥后的人工抗原可室温或4C保存。34河豚毒素标准品：纯度98。35 乙酸(CH。COOH)。36氢氧化钠(NaOH)。37 乙酸钠(cH。cOONa)。38乙醚。39 N，N-二甲基甲酰胺。310 3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)：4避光保存。311辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TTX单克隆抗体：一20保存，冷冻干燥后的酶标抗体可室温或4保存。312碳酸钠(Na2CO。)。313碳酸氢钠(NaHCO。)。314磷酸二氢钾(KH。Pq)。315磷酸氢二钠(Na：HP0412H：O)。316氯化钠(NaCl)。317氯化钾(Kcl)。318过氧化氢(H：0z)：4避光保存。31
4、9纯水(Milli Q系统净化)。320吐温一20(Tween-20)。321柠檬酸(c。H807-H：O)。322 98浓硫酸(H。S04)。】GBT 5009206m20074溶液配制41 02moiL Oil 40乙酸盐缓冲液的制备411 02 molL乙酸钠：164 g乙酸钠加纯水溶解并定容至1 000 mL。4。12 o2molL乙酸：114 g乙酸加纯水溶解并定容至1 000mL。413 02 molL pH 40乙酸盐缓冲液：取02 molL乙酸钠20 mL和02 molL乙酸80 mL混合而成。42 001 molL pit 74磷酸盐缓冲液(PBS)的制备分别称取KH：PO0
5、2 g、Na：HP0412H。0 29 g、NaCI 80 g、KCl 02 g，加纯水溶解并定容至1 000mL。43 TIX标准储备溶液的制备将河豚毒素标准品溶于02 molL pH 40乙酸盐缓冲液中，配成浓度为1_0 gL的标准储备液，密封后4保存备用。44ITX标准工作溶液的制备将TTX标准储备液用001 molL PBS配制成浓度分别为5 00000 t，gL、2 50000 ttgL、1 00000 tlgL、50000 tlgL、25000 tlgL、10000 tlgL、5000,gL、2500 tlgL、1000 tlgL、500 ttgL、100 ttgL、050 ttg
6、L、010 t-gL、005 ttgL的TTX标准工作溶液，工作溶液现用现配。45包被缓冲液(pit 9。6的005 toolL碳酸盐缓冲液)的制备分别称取Na。CO。159 g、NaHCO。293 g，加纯水溶解并定容至1 000 mL。LI6封闭液的制备20 g BSA加PBS溶解并定容至1 000mL。47洗液的制备9995 mL PBS溶液中加入05 mL的吐温一20。48抗体稀释液的制备1_0 g BSA加PBS溶解并定容至1 000mL。49底物缓冲液的制备491 01 molL柠檬酸溶液：2101 g柠檬酸(c6 H807H：O)加纯水溶解并定容至l 000 mL。492 02
7、molL磷酸氢二钠溶液：716 g Na：HPOt12Hz0加纯水溶解并定容至l 000 mL。493底物缓冲液：将01 toolL柠檬酸溶液、0molL磷酸氢二钠溶液和纯水按照243：257：50的比例现用现配。410底物溶液的制备4101 TMB储存液：200 mg TMB溶于20 mL N，N-二甲基甲酰胺中而成，4避光保存。4102底物溶液：将75 pL TMB储存液、10 mL底物缓冲液和10 pL HzO。混合而成。411终止液2 molL的H2S04溶液。取8915 mL 98的浓硫酸，缓缓加至盛有1085 mL纯水的容量瓶中混匀。412 01乙酸溶液1 mL乙酸加到999 mL
8、纯水中。413 1 molL NaOIt溶液40 g NaOH加纯水溶解并定容至1 000 mL。5仪器51组织匀浆器。252温控磁力搅拌器。53高速离心机。54全波长光栅酶标仪或配有450 ilm滤光片的酶标仪。55可拆卸96孔酶标微孔板。56恒温培养箱。57微量加样器及配套吸头(100 pL、200 pL和1 000 pL)。58分析天平(精密度万分之一)。59架盘药物天平。510 125 mL分液漏斗。511 100mL量筒。512 100mL烧杯。513剪刀。514漏斗。515 10mL吸管。516 100 mL磨口具塞锥形瓶。517容量瓶(50 mL、1 000 mL)。518 pH
9、试纸。519研钵。GBT 5009206-20076分析步骤61样品采集及运输现场采集样品后立即CC冷藏，并于当天运至实验室进行检验。如果路途遥远，可于当天进行冷冻，并应保存在冷冻状态中运输至检验实验室。62取样对冷藏样品或冷冻后解冻的样品，用蒸馏水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢(雄性为精囊)等部分，各部分组织分别用蒸馏水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重。63样品提取631将待测河豚组织用剪刀剪碎，加入5倍体积01的乙酸溶液(即1 g组织中加人01乙酸5 mL)，用组织匀浆器磨成糊状。632取相当于5 g河豚组织的匀浆糊(25 ra
10、L)于烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达100时持续10rain后取下，冷却至室温后，8 000 rrain离心15min，快速过滤于125mL分液漏斗中。633滤纸残渣用20mL 01乙酸分次洗净，洗液合并于原烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达100时持续3rain后取下，8 000 rmin离心15rain过滤，滤液合并于632分液漏斗中。634在632分液漏斗的清液中加入等体积乙醚振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏斗中并以等体积乙醚再重复脱脂一次，将水层放人100 mL锥形瓶中，减压浓缩去除其中残存的乙醚后，将提取液移人50 mL容量瓶中。635将634的提取液用
11、1molLNaOH溶液调pH至6570，并用PBS定容至50mL，立即用于检测(每毫升提取液相当于01 g河豚组织样品)。636当天不能检测的提取液经减压浓缩去除其中残存的乙醚后不用NaOH调pH，密封后一20以下冷冻保存，在检测前调节pH并定容至50 mL立即检测。64测定641包被酶标微孔板用BSA-HCHO-TTx人工抗原包被酶标板，120#L孔，CC静置12 h。GBT 5009206-2007642抗体抗原反应将辣根过氧化物酶标记的纯化TTX单克隆抗体稀释后分别：a)与等体积不同浓度的河豚毒素标准溶液在2 mL试管内混合后，CC静置lg h或37C温育2 h备用。此液用于制作TTX标
12、准抑制曲线。b)与等体积样品提取液在2 mL试管内混合后，4静置12 h或37温育2 h备用。此液用于测定样品中TTx含量。643封闭已包被的酶标板用PBS-T洗3次(每次浸泡3 min)后，加封闭液封闭，200 pL孔，置37温育2 h。644测定封闭后的酶标板用PBS-T洗3X 3 min后，加抗原抗体反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照)，100,L孔，37C温育2 h，酶标板洗53 min后，加新配制的底物溶液，100 pL孔，37温育10 min后，每孔加入50 pL 2 molL的HzSO。终止显色反应，于波长450 nm处测定吸光度值。65结果计算样品中TTX的含量按式(1)计算：Xm。VDv，m (1)式中：x样品中TTx的含量，单位为微克每千克(btgkg)；m，酶标板上测得的TTX的质量，单位为纳克(ng)，根据标准曲线按数值插入法求得；y样品提取液的体积，单位为毫升(mL)；D样品提取液的稀释倍数；V，酶标板上每孔加入的样液体积，单位为毫升(mL)；m样品质量，单位为克(g)。
