1、ICS 67050X 04 囝目中华人民共和国国家标准GBT 232 1 72008水产品中河豚毒素的测定液相色谱一荧光检测法Determination of tetrodotoxin in aquatic products-HPLCfluorescence detection method20081231发布 2009-050 1实施宰瞀徽鬻瓣警糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪1”月U 菁GBT 232172008本标准的附录A、附录B、附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出
2、入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨方、钱疆、刘正才、林中、张云、林永辉、陈健、庞国芳。水产品中河豚毒素的测定液相色谱一荧光检测法GBT 2321720081范围本标准规定了水产品中河豚毒素测定的液相色谱测定方法与液相色谱一串联质谱确证方法。本标准适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤、鱿鱼中河豚毒素的测定与确证。本标准方法的检出限为005 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其
3、最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 5725一l：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，1SO 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样中含有的河豚毒素采用酸性甲醇提取，提取液浓缩后，过C。s固相萃取小柱净化，液相色谱一柱后衍生荧光法测定，液相色谱一串联质谱
4、法确证，外标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙酸：色谱纯。43甲酸：色谱纯。44乙酸铵。45氢氧化钠。46庚烷磺酸钠。47 1乙酸甲醇溶液：移取10 mL乙酸，以甲醇稀释至1 L。48 1乙酸溶液：移取10 mL乙酸，以水稀释至1 L。49乙酸铵缓冲液：称取46 g乙酸铵和202 g庚烷磺酸钠，加入约700 mL水溶解，以乙酸调节pH值为50，以水稀释至1 Lo410 01甲酸水溶液：移取1 mL甲酸，加水稀释至1 L。411 4 molL氢氧化钠溶液：称取160 g氢氧化钠，以水溶解并稀释至1 L。412河豚毒素标
5、准物质(tetrodotoxin，分子式cll Hl 7N308，CAS 4368289)：纯度98。413标准贮备液(100 mgL)：准确称取河豚毒素100 mg，用少量水溶解后以甲醇定容至100 mL，该标准贮备液置于4冰箱中保存。1GBT 232172008414标准工作液：根据需要取适量标准贮备液，以01甲酸水溶液+甲醇(9+1，体积比)稀释成适当浓度的标准工作液。标准工作液当天现配。415基质标准工作液：以空白基质溶液配制适当浓度的标准工作液。基质标准工作液要当天配制。416 C。固相萃取柱，500 mg3 mL，用前依次以3 mL甲醇、3 mL 1乙酸溶液(48)活化，保持柱体湿
6、润。417滤膜：02 pm。418离心超滤管，截留相对分子质量为3 000，1 mL。5仪器51 液相色谱仪，带有荧光检测器与柱后衍生装置。52液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。53分析天平：感量01mg和001 g。54组织捣碎机。55旋涡振荡器。56超声波发生器。57减压浓缩装置。58固相萃取装置。59真空泵：真空度应达到80 kPa。510微量注射器：1 mL5 mL，100 pL1 000 pL。511离心机：转速达4 000 rmin。512离心机：转速达13 000 rrain，配有酶标转子。513冷冻高速离心机：转速达到18 000 rrain，可致冷4。514 KD
7、浓缩瓶：100 mL与z5 mL。6试祥的制备与保存制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。由于河豚毒索为剧毒物质，对于可能含有河豚毒素的产品，应避免直接接触或误食，相关的器皿和器具可以采用4碳酸钠溶液浸泡加热去毒处理。61试样制备从所取全部样品中取出有代表性样品的可食部分约500 g，切成小块，放人组织捣碎机均质，充分混匀，装入清洁容器内，并标明标记。62试样保存试样于一18以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在26贮存72 h。7测定步骤71提取称取500 g匀浆样品置于50mL聚丙烯离心管中，加入20mLl乙酸甲酵溶液(47)，旋据振荡2 rain，50水浴超声提取20 mi
8、n，4 000 rrain离心5 min，取上清液，在残渣中再加入20 mL 1乙酸甲醇溶液，重复以上步骤，合并上清液，过滤至100 mL KD浓缩瓶中，60旋转蒸发浓缩至近干，加入2mLl乙酸溶液(48)，振荡洗涤浓缩瓶，转移至10mL聚丙烯离心管中，4下于18 000 rmin离心10 min，取上清液待净化。72净化将71所得的澄清溶液以约1 mLmin的流速过柱，用10 mL 1乙酸溶液(48)洗脱，合并流出液2GBT 232172008与洗脱液，置于25 mL KD浓缩瓶中，于60下减压浓缩至近干，用1乙酸溶液(48)定容1 mL，过02 pm滤膜，供液相色谱分析。进行液相色谱一串联
9、质谱确证时，将样液装入离心超滤管中，13 000 rmin离心15 min，取滤液测定。73空白基质溶液的制备称取阴性样品500 g，按71和72操作。74测定条件741液相色谱参考条件a) 色谱柱：Purospher Star PR-18e C18柱，5 pm，250 mmX46 mm(内径)或相当者；b)柱温：30；c) 流动相：乙腈一乙酸铵缓冲液(49)(1+19)；d)流速：10mLmin；e)激发波长：385 nm，发射波长：505 nm；f)进样量：400 pL。742柱后衍生参考条件a)衍生溶液：4 molL氢氧化钠溶液(411)；b)衍生溶液流速：05 mLmin；c)衍生管温
10、度：110。743色谱测定根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中河豚毒素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，河豚毒素的参考保留时间为103 min，根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并外标法定量。标准品高效液相色谱图参见图A1。75确证751 液相色谱一串联质谱条件a)色谱柱：Atlantis“HILIC Silica”3 pm，150 mmX 21 ram(内径)或相当者；b)流动相：乙腈一01甲酸溶液(410)(17+8)；c)柱温：30；d)进样量：10 pL；e)
11、流速：200 pLmin；f) 离子源：电喷雾源ESI，正离子模式；g)扫描方式：多反应监测(MRM)；h)离子源温度：500；i)雾化气、气帘气、辅助加热气、硅e撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；j)仪器工作所需电压值应优化至最优灵敏度；k)定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量见表1。表1 定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量l化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(m：) 碰撞气能量V 碰撞池出口电压V320302 30 60河豚毒素 320162320162 30 601)Atlantis
12、TM HILIC Silica色谱柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3GBT 232172008752液相色谱一串联质谱确证将基质标准工作液和72中所得滤液(必要时用乙腈稀释至适当浓度)用LC-MSMS测定。如果样液中与标准工作液相同的保留时间有检测离子峰出现，则对其进行质谱确证。河豚毒素标准溶液的液相色谱一串联质谱图参见图B1。753定性标准7531保留时间待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在士25之内。7532信噪比待测化合物的定性离子的重构离子色谱
13、峰的信噪比应大于等于3(SN3)。7533定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许的相对偏差 士20 土25 士30 士5076平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。77回收率试验在阴性样品中添加适量标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。河豚毒素的添加浓度及其回收率范围的试验数据参
14、见表C1。8结果计算用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式(1)计算试样中河豚毒素含量：x一!二鱼!丕! (1)优式中：x试样中河豚毒素含量的数值，单位为微克每千克(pgkg)；c由标准曲线而得的样液中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升(pgL)；cD由标准曲线而得的空白实验中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升(-gL)；y样品最终定容体积，单位为毫升(mL)；m最终样液代表的试样量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算的。92重复性在重复性条件下，获
15、得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表3。4GBT 232172008表3 河豚毒素的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为毫克每千克化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限r 再现性限R河豚鱼 lgr一0800 6lgm 0268 9 lgR=0947 llgm一0432 9河豚毒素 50500织纹螵 lgr一0866 7】gm O233 8 IgR=0982 619in-0667 3注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对
16、差值不超过再现性限(R)，被测物的添加浓度范匿及再现性方程见表3。5GBT 232172008附录A(资料性附录)标准物质液相色谱图河豚毒素标准物质液相色谱图见图A1。100 2 00 3 00 4 00 5 00 6 00 7 00 8 00 9 00 10li 00 12 001300 140015 00tmin图A1 河豚毒素标准物质液相色谱图附录B(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱圈河豚毒素标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图B1。GBT 232172008围B1 河豚毒素标准品的多反应监测(MRM)色谱图tmin咖咖枷|枷。GBT 232 172008附录c(资料性附录)回收率河豚毒素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表C1。表c1 河豚毒素的添加浓度及其平均回收率的试验数据添加浓度 平均回收率(mgkg) 鱿鱼 花蛤 河豚鱼 虾 织纹螺 牡蛎005 895 928 893 951 911 9530i0 806 775 830 838 852 825025 824 785 823 823 939 94 7050 974 858 85 4 846 879 92 9
