1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准G/T 5009.86-2003 代替GB/T12392一1990蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2，4-二硝基苯脐法)Determination of total ascorbic acid in fruits , vegetables and derived products-Flourometric method and colorimetric method 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布623 GB/T 5009.86-2003 前言本标准第一法对应于
2、ISO6557-, 1986(蔬菜、水果及其制品中抗坏血酸的测定方法和AOAC967.22(维生素制品中总维生素C的微量荧光测定方法儿本标准与ISO6557-1和AOAC967. 22的一致性程度为非等效。本标准代替GB/T12392-1990(蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法(荧光法和2，4-二硝基苯脐法门。624 本标准与GB/T12392-1990相比主要修改如下.修改了标准的中文名称，标准中文名称改为蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2，4-二硝基苯脐法) ; 一一按GB/T20001. 4-2001 (标准编写规则第4部分:化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本
3、标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。本标准主要起草人z王光亚、杨晓莉、田立新。原标准于1990年首次发布，本次为第一次修订。GB/T 5009.86-2003 1 范围蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2，4-二硝基苯阱法)本标准规定了用荧光法和2，4-二硝基苯脐比色法测定食品中的抗坏血酸。本标准适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。本方法检出限z荧光法为0.022g/mL，2，4-二硝基苯脐比包法为O.1g/mL。线性范围荧光法为5g/mL20g/mL，2，4-二硝基苯脐比色法为1g/mL12g/mL.第一法荧光法2
4、 原理试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胶(PDA)反应生成有荧光的喳唔琳(quinoxaline)，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。脱氢抗坏血酸与棚酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。3 试剂3. 1 偏磷酸乙酸液=称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL。于4C冰箱可保存7d10 d. 3.2 0.15 mol/L硫酸s取10mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200 mL. 3.3偏磷酸乙酸硫酸液以0.15mol/
5、L硫酸液为稀释液，其余同3.1配制。3.4 乙酸纳溶液(500g/Ll，称取500g乙酸锵(CH3COONa3H20)，加水至1000 mL。3.5 砌酸乙酸销溶液z称取3g唰酸，溶于100mL乙酸锅溶液(3.4)中。临用前配制。3.6 邻苯二胶溶液(200mg/L) ，称取20mg邻苯二胶，临用前用水稀释至100mL。3.7 抗坏血酸标准溶液。mg/mLl(临用前配制)，准确称取50rng抗坏血酸，用偏磷酸乙酸溶液(3. 1)溶于50rnL容量瓶中，并稀释至刻度。3.8 抗坏血酸标准使用液(100g/mL)，取10mL抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀辑至100 mL，定容前试pH值，如其
6、pH2.2时，则应用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液(3.3)稀释。3. 9 O. 04 %百里盼蓝指示剂溶液g称取O.1 g百里盼蓝，加0.02rnol/L氢氧化纳溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化纳的用量约为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL, 变色范围:pH值等于1.2pH值等于2.8 红色黄色pH值大于4蓝色3. 10 活性炭的活化加200g炭粉于1L盐酸0+9)中，加热回流1h2 h，过滤，用水洗至滤液中元铁离子为止，置于11OC120C烘箱中干燥，备用。4 仪器4. 1 实验室常用设备。625 GB/T 5009.86-2003 4.2 荧光分光光度计或具有350nm及430nm波
7、长的荧光计。4.3 捣碎机。5 分析步骤5. 1 试样的制备称取100g鲜样，加100mL偏磷酸乙酸溶液(3.1)，倒入捣碎机内打成匀浆，用百里盼蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色，则用偏磷酸乙酸硫酸溶液稀释，使其pH为1.20均浆的取量需根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样液含量在40Ig/mL 100g/mL之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL，过滤，滤液备用。5.2 测定5. 2. 1 氧化处理分别取试祥滤液(5.1)及标准使用液(3.的各100mL于200mL带盖三角瓶中，加2 g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫
8、升滤液，分别收集其余全部滤液，即试样氧化液和标准氧化液，待测定。5.2.2 各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明标准及标准空白。5.2.3 各取10mL试样氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明试样及试样空白。5.2.4 于标准空白及试样空白溶液中各加5mL棚酸乙酸销溶液，混合摇动15min，用水稀释至100 mL，在40C冰箱中放置2h3 h，取出备用。5.2.5 于试样及标准溶液中各加人5mL 500 g/L乙酸纳液，用水稀释至100mL，备用。5.3 标准曲线的制备取上述标准溶液(5.2.5)(抗坏血酸含量10g/mL)0.5、1.0、1.5和2.0mL标准系列，取
9、双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mLo荧光反应按5.4操作。5.4 荧光反应取5.2.4中标准空白溶液，试样空白溶液及5.2.5中试样溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胶溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发光波长338nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算使用。6 结果计算见式(1)。式中z100 X . XFX ( 1 ) m ,. 1 000 x 试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，单位为毫克
10、每百克(mg/100g); t 由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，单位为微克每毫升(g/mL); m 试样的质量，单位为克(g); V 荧光反应所用试样体积，单位为毫升(mL); F 试样溶液的稀释倍数。计算结果表示到小数点后一位。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。626 GB/T 5009.86-2003 第二法2，4二硝基苯脐比色法B 原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二嗣古乐糖酸，试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4二硝基苯脐作用生成红色脉，根据滕在硫酸溶液中的含量与抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。9试剂
11、9. 1 4. 5 mol/L硫酸2谨慎地加250mL硫酸(相对密度1.84)于700mL 水中，冷却后用水稀释至1000mL 9.2 85 %硫酸:谨慎地加900mL硫酸(相对密度1.84)于100mL水中。9.32.4-二硝基苯脐溶液(20g/U，溶解2g 2.4-二硝基苯脐于100时.4. 5 mol/L硫酸中，过洁、。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。9.4 草酸溶液(20g/U，溶解20g草酸(H2C20，)于700mL水中，稀释至1000 mLo 9.5 草酸溶液(10g/L)，取500mL草酸溶液(9.4)稀释至1000 mLo 9.6 硫腮溶液(10日/U，溶解5g硫服于50
12、0mL草酸溶液(9.5)中。9. 7 硫腺溶液(20g/U ，溶解10g硫服于500mL草酸溶液(9.5)中。9.8 1 mol/L盐酸:取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200 mL 9.9 抗坏血酸标准溶液z称取100mg纯抗坏血酸溶解于100mL草酸溶液C9. 4)中，此溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸。9. 10 活性炭z将100g活性炭加到750mL 1 mol/L盐酸中，因流1h2 h.过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子CFe3+)为止，然后置于110C烘箱中烘干。检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氧化何与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色
13、沉淀。10 仪器10. 1 恒温箱，37C土0.5C。10.2 可见紫外分光光度计。10. 3 捣碎机。1 1 分析步骤11. 1 试样的制备全部实验过程应避光。11.1. 1 鲜样的制备=称取100g鲜样及吸取100mL 20 g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10g 40 g匀浆(含1mg2 mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。11. 1. 2 干样制备z称1g4 g干样(含1mg2 mg抗坏血酸)放入乳钵内，加入10g/L草酸溶液磨成匀浆，倒人100mL容量瓶内，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。11.1. 3 将11.1.1和11.1.
14、 2液过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后，倾出上清液，过滤，备用。11. 2 氧化处理取25mL上述滤液，加人2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL 20 g/L硫腺溶液，混匀，此试样为稀释液。627 GB/T 5009.86-2003 11. 3 呈色反应11. 3. 1 于三个试管中各加入4mL稀释液(11.2)。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0 mL 20 g/L 2.4二硝基苯脐溶液，将所有试管放入370C土0.50C恒温箱或水浴中，保温3h。11. 3. 2 3 h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取
15、出后使其冷到室温，然后加入1. 0 mL 20 g/L 2.4二硝基苯脐溶液，在室温中放置10 min 15 min后放入冰水内。其余步骤同试样。11. 4 85%硫酸处理当试管放入冰水后，向每一试管中加人5mL 85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管白冰水中取出，在室温放置30min后比色。11. 5 比色用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。11. 6 标准曲线的绘制11. 6. 1 加2g活性炭于50mL标准溶液中，振动1min，过滤。11. 6. 2 取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫服，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，抗坏血
16、酸浓度20g/mL11. 6. 3 取5.10.20.25.4日.50.60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用10g/L硫腺溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12g/mL11. 6. 4 按试样测定步骤形成滕并比色。11. 6. 5 以吸光值为纵坐标，抗坏血酸浓度(g/mL)为横坐标绘制标准曲线。12 结果计算见式(2)。式中z100 X. , XFX一一一-( 2 ) m . ,- ., 1 000 X 试样中总抗坏血酸含量，单位为毫克每百克(mg/100g); c 由标准曲线查得或由回归方程算得试样氧化液中总抗坏血酸的浓度，单位为微克每毫升(g/mL) ; V 试样用10g/L草酸溶液定容的体积，单位为毫升(mL)。F 试样氧化处理过程中的稀释倍数;m 试样的质量，单位为克(g)。计算结果表示到小数点后两位。13 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。628
