1、ICS 67.040 C 53 GB 中华人民共和国国家标准G/T 5009.96-2003 代替GB/T13111-1991 谷物和大豆中插曲霉毒素A的测定Determination of ochratoxin A in cereals and soybeans 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员再GBjT 5009.96-2003 . 目。言本标准代替GBjT13111-1991(谷物和大豆中插曲霉毒素A的测定方法。本标准与GBjT13111-1991相比主要修改如下:一一修改了标准的中文名称，标准中文名称改为谷物和大豆中插曲霉毒
2、素A的测定h一一按GBjT2000 1. 4一年2001(标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位z卫生部食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、黑龙江省食品卫生监督检验所、北京市卫生防疫站、山西省卫生防疫站。本标准主要起草人.魏润蕴、鲍风珍、方晓明、杨貌端、高晓岚。原标准于1991年首次发布，本次为第一次修订。682 GB/T 5009.96-2003 谷物和大豆中插曲霉毒素A的测定1 范围本标准规定了谷物和大豆中搪曲霉毒素A的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆中插曲霉毒素A的测定。本方法的检出限为1
3、0g!险。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5009. 22-2003 食品中黄曲霉毒素区的测定3 原理用三氯甲统-0.1mol!L磷酸或石油隧-甲醇/水提取试样中的插曲霉毒素A，试样提取液经液-液分配后，根据其在365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。4试J4.1 石油隧(60C90C或30C60C)。4.2 甲碎。4
4、.3 三氯甲烧。4.4 甲苯。4.5 乙酸乙醋。4.6 甲酸。4.7 冰乙酸。4.8 乙醋。4.9苯乙腊(98+2)。4. 10 0.1 mol/L磷酸c(凡P04)0.1mol/LJ，称取11.5 g磷酸(85%)加水稀释至1000mL, 4.11 2 mol/L盐酸溶液c(HCD2 mol/LJ，量取20mL盐酸，加水稀释至120mL。4.12 氯化纳溶液(40g/L)。4. 13 0.1 mol/L碳酸氢纳溶液c(NaHC03)O. 1 mol!LJ，称取8.4g碳酸氢销，加适量水溶解，并用水稀释至1000mL, 4.14 硅胶G，薄层层析用。4.15 赫曲霉毒素A标准品(以下简称OA)
5、。4.16 筋曲霉毒素A标准溶液:4.16.1 筛曲霉毒素A标准贮备液:用苯一冰乙酸(99+1)配成40g/mL路曲霉毒素A标准贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定按照GB/T5009.22-2003中3.14(插曲霉毒素A的最大吸收峰波长333nm，分子量403，克分子消光系数值为5550)。置冰箱中避光保存。4.16.2 筛曲霉毒素A标准使用液g精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含插曲霉毒素AO.5吨，置冰箱中避光保存。683 GB/T 5009.96-2003 5 仪器所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水、蒸馆水冲洗。5.1 小型粉碎机。5.2 电动振荡器。5.3 玻璃板，5
6、cmX20 cm。5.4 薄层涂布器。5.5 展开槽:内长25cm、宽6cm、高4cm。5.6 紫外光灯，365nmo 5.7 微量注射器，10uL.50Lo 5.8 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。6 分析步骤6.1 试样的制备称取250g试样经粉碎并通过20目筛后备用。6.2 提取6.2.1 甲法称取约20g试样，精确至0.001g.置于200mL具塞锥形瓶中，加入100mL三氯甲统和10mL 0.1 mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤$取20mL滤液置于250mL分液漏斗中，加50 mL O. 1 mol/L碳酸氢饷溶液振摇2min，静置分层后，将三氯甲烧层放入另一
7、个100mL分液漏斗中(少量乳化层，或即使三氯甲烧层全部乳化都可放入分液漏斗中).加入50mL O. 1 mol/L碳酸氢销溶液重复提取三氯甲烧层，静置分层后弃去三氯甲烧层(如三氯甲烧层仍乳化，弃去，不影响结果)。碳酸氢纳水层并入第一个分液漏斗中，加约5.5 mL 2 mol/L盐酸溶液调节pH23(用pH试纸测试)，加人25 mL三氯甲烧振摇2min，静置分层后，放三氯甲炕层子另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水层再用10mL三氯甲烧振摇、提取、静置，将三氯甲烧层并人同一分液漏斗中。振摇、静置分层，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲统层于一75mL蒸发皿中，将蒸发皿置蒸气浴上通风
8、挥干。用约8 mL三氯甲烧分次将蒸发皿中的残渣溶解，转人具尾管的10mL浓缩瓶中，置80(;水浴锅上用蒸汽加热吹氮气(陀浓缩至于，加入0.2mL苯乙腊(98+2)溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样用.6.2.2 乙法称取20g粉碎并通过20目筛的试样加于200mL具塞锥形瓶中，加30mL石泊腿和100mL甲醇-水(55十4日，在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇-水层分清后，取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中，用pH试纸测试，一般为pH56。加入25mL三氯甲烧振摇2mn，静置分层后放出三氯甲锐层于另一分液漏斗中，再用10mL三氯甲烧重复振
9、摇提取甲醇-水层(在用三氯甲烧振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层)，将三氯甲烧层合并于同一分液漏斗中，加入50mL100 mL氯化锅溶液(4.12)(加人量视品种不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL左右)，振摆放置(如为大豆试样提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。生日乳化严重可加入少许甲醉)，待三氯甲烧层澄清后，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烧层于75mL蒸发皿中(如为大豆试样须再加入10mL三氯甲烧振摇，三氯甲烧层合并于同蒸发皿中).将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。以下操作自用约8mL三氯甲统分次将蒸发皿中的残渣溶解起，按甲法操作。6.3 测定6.3
10、.1 藩层板的制备称取4g硅胶G，加约10mL水于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成5cmX 20 cm，厚度684 GB/T 5009.96-2003 0.3 mm的薄层板三块，在空气中干燥后，在105C110C活化1h.取出放干燥器中保存。6.3.2 点样取两块薄层板，在距薄层板下端2.5cm的基线上用微量注射器滴加两个点z在距板左边缘1.7 cm 处滴加OA标准溶液8L(浓度0.5g/mL).在距板左边缘2.5cm处滴加样液25L.然后在第二块板的样液点上加滴OA标准溶液8L(浓度0.5问ImL)。点样时，需边滴加边用电吹风吹干，交替使用冷热风。6.3.3 展开6.3.3.1 展开剂
11、横展JiiJ，乙酷或乙隧-甲醇-水(94+5+1)。纵展弗tl，a) 甲苯-乙酸乙酣-甲酸-水(6+3+1. 2+0. 06)或甲苯乙酸乙酶-甲酸(6+3+1. 4); b) 苯-冰乙酸(9+1)。6.3.3.2 展开横向展开g在展开槽内倒入10mL横展剂，先将薄层板纵展至离原点2cm-.3 cm，取出通风挥发溶剂1min-2 min后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可添加适量，展至板端过1min，取出通风挥发榕剂2min-3 mino 纵向展开2在另一展开槽内倒入10mL纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13cm 15 cm.取出通风挥干至板面
12、无酸味(约5min 10 min)。6.3.4 观察与评定将薄层色谱板置365nm波长紫外光灯下观察。a) 在紫外光灯下将两板相互比较，若第二块板的样液点在OA标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则试样中的OA含量在本测定方法的最低检测量10g/kg以下。b) 如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点则看第二板样液的荧光点是否与滴加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。6.3.5 稀释定量比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。薄层板经双向展开后，当阳性样品中OA含量高时.OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿色荧光点。这
13、是因为在横展过程中原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了，这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时可在样液点的左边基线上滴加两个标准点.OA的量可为4ng.8ng。比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概珞定量6.3.6 确证试验用碳酸氢锅乙醇溶液(在100mL水中溶解6.0g碳酸氢锅，加20mL乙醇喷洒色谱板，在室温下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，可使方法检出限达5g/地，但概略定量仍按喷洒前所显黄绿色荧光计。7 结果计算式中gV、1000 Xmj X古土XDX一一一V2 m X一一试样中筛曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克(/Lg/kg); mj一薄层板上测得样液点上OA的量，单位为微克(g);685 GB/T 5009.96-2003 D 样液的总稀释倍数，V, 苯-乙腾混合液的体积，单位为毫升(mL);V，-一-出现最低荧光点时滴加样液的体积，单位为毫升(mL)，m一一苯乙腑溶解时相当样品的质量，单位为克(g)。B 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。686
