1、 中华人民共和国国家标准 谷物和大豆中赭曲霉毒素 A GB/T 13111-91 的测定方法 Method for determination of ochratoxin A in cereal and bean 1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素 A 的薄层色谱测定方法。 本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素 A 的测定。 在薄层板上赭曲霉毒素 A 的最低检出量为 4ng。本方法的最低检测量为 10 g/kg 。 2 原理 用三氯甲烷-0.1mol/L 磷酸或石油醚- 甲醇/ 水提取样品中的赭曲霉毒素 A，样品提取 液经液- 液分配后，根据其在 365 nm 紫外
2、光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准 比较测定含量。 3 试剂 以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。 3.1 石油醚(60 90或 30 60 )。 3.2 甲醇。 3.3 三氯甲烷。 3.4 甲苯。 3.5 乙酸乙酯。 3.8 甲酸。 3.7 冰乙酸。 3.8 乙醚。 3.9 苯 -乙腈(98 ： 2)。 3.10 0.1mol/L 磷酸c(H3PO4)=0.1mol/L ：称取 11.5g 磷酸(85%) 加水稀释至 1000mL。 3.11 2mol/L 盐酸溶液c(HCL)=2mol/L ：量取 20 mL 盐酸，加水稀释至 120 mL。 3.12 4
3、%氯化钠溶液。 3.13 0.1mol/L 碳酸氢钠溶液c(NaHCO3)=0.1mol/L ：称取 8.4g 碳酸氢钠, 加适量水溶解， 并用水稀释至 1000 mL。 3.14 硅胶 G：薄层层析用。 3.15 赭曲霉毒素 A(以下简称 OA)标准溶液：用苯- 冰乙酸(99 ： 1)配成 40 g/mL 赭曲霉毒 素 A 贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照 GB 5009.22食品中黄曲 霉毒素 B1 的测定方法中 2.14 条 (赭曲霉毒素 A 的最大吸收峰波长 333 nm，分子量 403，克 分子消光系数值为 5550)。精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素
4、 A0.5 g，赭 曲霉毒素 A 标准液应置冰箱中避光保存。 4 仪器 所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水，蒸馏水冲洗。 4.1 小型粉碎机。 4.2 电动振荡器。 4.3 玻璃板：5cm 20cm。 4.4 薄层涂布器。 4.5 展开槽：内长 25cm、宽 6cm、高 4cm。 4.6 紫外光灯：365 nm 。 4.7 微量注射器：10 L、 50 L 。 4.8 具 0.2mL 尾管的 10 mL ，小浓缩瓶。 5 分析步骤 5.1 提取 5.1.1 甲法 称取 20g 粉碎并通过 20 目筛的样品，置于 200mL 具塞锥形瓶中，加入 100mL 三氯甲烷 和 10mL 0.1mo
5、l/L 磷酸，振荡 30min 后通过快速定性滤纸过滤；取 20ml，滤液置于 250mL分 液漏斗中, 加 50mL 0.1mol/L 碳酸氢钠溶液振摇 2min,静置分层后，将三氯甲烷层放入另一 个 100mL 分液漏斗中( 少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中) ，加 入 50mL 0.1mol/L 碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层, 静置分层后弃去三氯甲烷层( 如三氯 甲烷层仍乳化, 弃去, 不影响结果) 。 碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中, 加约 5.5mL 2mol/L 盐酸溶液调节 pH2 3(用 pH 试纸测试) ， 加入 25mL 三氯甲烷振摇 2min，静
6、置分层 后 ,放三氯甲烷层于另一盛有 100mL 水的 250mL 分液漏斗中, 酸水层再用 10mL 三氯甲烷振摇、 提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层, 用脱脂棉擦干分液漏 斗下端，放三氯甲烷层于一 75ml 蒸发皿中，将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约 8mL 三氯 甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的 10mL 浓缩瓶中, 置 80水浴锅上用蒸汽加 热吹氮气(N2), 浓缩至干, 加入 0.2mL 苯 -乙腈(98 ： 2)溶解残渣, 摇匀, 供薄层色谱点样用。 5.1.2 乙法 称取 20g 粉碎并通过 20 目筛的样品加于 200mL 具塞锥形瓶中 ,加
7、 30mL 石油醚和100mL 甲 醇 -水 (55： 45)，在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡 30min 后，通过快速定性滤纸滤入分 液漏斗中，待下层甲醇水层分清后，取出 20mL 滤液置于 100mL 分液漏斗中 ,用 pH 试纸测试 , 一般为 pH5 6。加入 25mL 三氯甲烷振摇 2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗 中，再用 10mL 三氯甲烷重复振摇提取甲醇- 水层( 在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现 象，可滴加甲醇促使其分层) ，将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入 50 100mL 4% 氯化钠溶液( 加入量视品种不同而异，大豆加 100mL，小麦、玉米
8、则加 50mL 左右) ，振摇放 置 (如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可 加入少许甲醇), 待三氯甲烷层澄清后, 用脱脂棉擦干分液漏斗下端, 放三氯甲烷层于 75mL 蒸 发皿中( 如为大豆样品须再加入 10mL 三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中) ，将 蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。 以 下操作自“用约 8mL 三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起，按甲法操作。 5.2 测定 5.2.1 薄层板的制备 称取 4g 硅胶 G,加约 10mL 水于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成 5cm20cm, 厚度 0.3mm 的薄层板三块, 在空气中干
9、燥后, 在 105 110活化 1h，取出放干燥器中保存。 5.2.2 点样 取两块薄层板，在距薄层板下端 2.5cm 的基线上用微量注射器滴加两个点：在距板左 边缘 1.7cm 处滴加 OA 标准溶液 8L( 浓度 0.5g/mL), 在距板左边缘 2.5cm 处滴加样液 25 L, 然后在第二块板的样液点上加滴 OA 标准溶液 8 L(浓度 0.5 g/mL)。点样时, 需边滴加边用 电吹风吹干，交替使用冷热风。 5.2.3 展开 5.2.3.1 展开剂 横展剂：乙醚或乙醚- 甲醇- 水 (94： 5： 1)。 纵展剂：a. 甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸- 水 (6： 3： 1.2： 0.06
10、)或甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸 (6： 3： 1.4)； b.苯 -冰乙酸(9 ： 1)。 5.2.3.2 展开 横向展开：在展开槽内倒入 10mL 横展剂，先将薄层板纵展至离原点 23cm ，取出通风 挥发溶剂 12min 后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展, 如横 展剂不够，可添加适量，展至板端过 1min，取出通风挥发溶剂 2 3min。 纵向展开：在另一展开槽内倒入 10mL 纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点 13 15cm。取出通风挥干至板面无酸味( 约 5 10min)。 5.2.4 观察与评定 将薄层色谱板置 365nm 波长紫外光灯下观察。 a.
11、在紫外光灯下将两板相互比较，若第二块板的样液点在 OA 标准点的相应处出现最 低检出量，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则样品中的 OA 含量在本测定方法的最低 检测量 10 g/kg 以下。 b.如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点则看第二板样液的荧 光点是否与滴加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。 5.2.5 稀释定量 比较样液中 OA 与标准 OA 点的荧光强度，估计稀释倍数。 薄层板经双向展开后，当阳性样品中 OA 含量高时， OA 的荧光点会被横向拉长，使点 变扁，或分成两个黄绿色荧光点。这是因为在横展过程中原点上 OA 的量超过了硅胶的吸附 能力，原点
12、上的杂质和残留溶剂在横展中将 OA 点横向拉长了，这时可根据 OA 黄绿色荧光的 总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含 量时，可在样液点的左边基线上滴加二个标准点，OA 的量可为 4ng、 8ng，比较样液与两个 标准 OA 荧光点的荧光强度，概略定量。 5.2.6 确证试验 用碳酸氢钠乙醇溶液 (在 100mL 水中溶解 6.0g 碳酸氢钠, 加 20mL 乙醇) 喷洒色谱板，在 室温下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时 OA 荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度 有所增加，再估计样品中 OA，如果与喷洒前情况不一致，要利用喷洒前所做的估计。 6 计
13、算 样品中赭曲霉毒素 A 的含量可按下式计算。 V1 1000 x= A D V2 m 式中 x 样品中赭曲霉毒素 A 的含量，g/kg; A薄层板上测得样液点上 OA 的量，g; D样液的总稀释倍数； V1苯- 乙腈混合液的体积，mL； V2出现最低荧光点时滴加样液的体积，mL； m苯- 乙腈溶解时相当样品的质量，g 。 7 精密度 本方法经五个协作者验证， 在 OA 加入量分别为 10,50,100g/kg 水平、每个水平 n=2 时，方法的回收率用 X 表示、精密度用 SD 表示： 小麦分别为 93 10.23； 92 14.72； 105 38.85。 玉米分别为 88 9.68;88 9.68;103 41.2。 上述数据为(X SD)% 附加说明： 本标准由卫生部卫生监督司提出。 本标准由卫生部食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、黑龙江省食品卫 生监督检验所、北京市卫生防疫站、山西省卫生防疫站负责起草。 本标准主要起草人魏润蕴、鲍凤珍、方晓明、杨貌端、高晓岚。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部 1991-06-07 批准 1992-03-01 实施
