1、ICS 65. 120 B 20 道雪中华人民共和国国家标准G/T 8381.6-2005 配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法Method for determination of deoxynivalenol in formula feed一Thin layer chromatography 2005-09-05发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2006-02-01实施发布GB/T 8381.6一2005前言本标准参考了GB/T14929.5-1994(谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业
2、标准化技术委员会归口。本标准由农业部饲料质量监督检验测试中心(沈阳)负责起草，吉林省兽药监察所、国家饲料质量监督检验中心(北京)参加起草。本标准主要起草人:陈莹莹、曹东、董永亮、肖勇、李雪兰、李广生、刘同民、杨曙明。1 范围配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法本方法的检出限为lmgy 2 规范性引用文件的修改单(不包括勘误是否可使用这些文件GB/ T 14699. 1 3 原理配合饲料中在制备薄层板时力层板上显示荧光4 试剂4.1 4.2 4. 3 4. 4 4.5 4.6 4. 7 4.8 4.9 甲醇-水，4+1。4. 10 甲醇-丙酣，1十2。4. 11 三氯甲皖-乙睛，4+1。
3、4.12 甲苯-乙酸乙醋甲酸，6+3+1。4.13 中性氧化铝，层析用，经3000C活化4h，置干燥器中备用。G/T 8381.6一20054. 14 活性炭:取20g活性炭，用27%体积分数)盐酸溶液浸泡过夜、抽洁、后，用热蒸馆水洗至无氯离子，在1200C烘干备用。1) D0156是美国Sigma公司的商品代号。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GB/T 8381. 6-2005 4.15 DON标准品榕液:称取5.0mgDON标准品，准确到0.1mg，用乙酸乙醋甲醇(4.7)府解，转入10 mL容量瓶中，再
4、用乙酸乙醋句甲醇稀释至刻度，此溶液含DONO. 5 mg/mL。吸取此标准榕液0.5 mL，用乙酸乙醋甲醇稀释至10mL，此溶液含DON25g/mL。5 仪器和设备5. 1 分析天平:感量0.0001 g。5.2 天平:感量0.01g. 5.3 小型粉碎机。5.4 电动震荡器。5.5 旋转蒸发器。5.6 层析柱:内径2cm.长10cm。5. 7 刻度吸管:容量10mL、25mL。5.8 具塞浓缩瓶:容量10mL，底部具0.2mL刻度尾管。5.9 玻璃板:规格5cmX20 cm。5. 10 薄层涂布器:涂布厚度0.3mm。5. 11 展开槽:卧式，内长25cm，宽6cm，高4cm;立式，内长10
5、cm，宽6cm.高25cm。5.12 紫外光灯:波长365nm。5. 13 微量注射器:10L、25L6 试样的制备将按GB/T14699. 1取得的样品，四分法缩分，取约200g，经粉碎，全部过1mm孔筛，混匀，装入磨口瓶中备用。7 测定步骤7. 1 提取称取20g试样(6)，精确到0.01g，置200mL具塞锥形瓶中，加8mL水和100mL三氯甲皖-元水乙醇(4.的，密塞，在瓶塞上涂层水，盖严防漏。振荡1h.通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤掖于100 mL蒸发瓶中，置旋转蒸发器(5.5)上45.C减压蒸发至干。7.2 净化7.2. 1 液一液分配用100mL石油酷(4.3)分次榕解蒸
6、发瓶中的残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用30mL甲醇水(4.9)分次洗涤蒸发瓶，转入同一分液漏斗。振摇分液漏斗1.5 min，静置约15min，使分层后，将下层甲醇-水提取液过净化柱，不要将两交界处的白色絮物放入柱内。7.2.2 柱净化在层析柱(5.的下端塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝(4.13)，敲平表面，再加人0.5g活性炭(4.14)，敲紧。将层析柱下端插入胶塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放入一平底管接收流出液。打开真空泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速不超过3mL/min，提取液过柱快完毕时，加入10mL甲醇水淋洗柱，继续
7、抽滤，直至不再有液体流出。7.3 试料溶液的制备过柱后的流出液(7.2.2)转人100mL蒸发瓶中，置旋转蒸发器上，450C减压蒸发至干。取下蒸发瓶置沸水浴上至完全干燥，趁热加入3mL乙酸乙醋(4.2)，加热至沸腾，在水浴上轻轻地反复摇动蒸发瓶，使残渣中的DON洛出，放冷至室温后转入浓缩瓶(5.8)中。加约0.5mL甲醇-丙酣(4.10)于蒸发瓶中，超声破碎残渣，将蒸发瓶置水浴上挥干梅剂后，加入3mL乙酸乙醋，加热至沸，转动蒸发瓶，使充GBjT 8381.6-2005 分沸腾，放冷至室温后转入同一浓缩瓶中，再用0.5mL甲醇-丙酬和3mL乙酸乙醋同样处理一次，乙酸乙醋并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置约
8、950C水浴上，蒸汽加热浓缩至干，放冷至室温后，准确加入0.2mL 三氯甲皖皿乙腊(4.11)榕解残渣留做薄层层析用。7.4 测定7.4. 1 薄层板的制备取4g硅胶G(4.肘，加15%氯化铝(4.5)溶液约9mL，研磨2min至呈粘稠状，铺成5cmX 20 cm 的薄层板三块，置室温干燥后，于1050C活化1h，贮干燥器中备用。7.4.2 点样在距薄层板(7.4.1)下端2.5cm处为基线点样。在距板左边缘O.8 cml cm处点试料榕液(7.3) 1L，在距左边缘2.0cm处点1L标准品榕液(4.1日，在距右边缘1.2 cm处点2L标准品榕液。再在距板上端1.5 cm处点三个标准品榕液各2
9、L，使之与基线上三个点的位置相对应。7.4.3 展开7.4.3.1 横展以乙酷(4.4)为横展剂，在卧式展开槽内倒入10mL展开剂，将点好样的薄层板(7.4. 2)靠试料榕液点的长边斜浸入展开剂，展至板端过1min2 min，使试料中的DON偏离原点O.7 cml cm，取出通风挥干3min。再用10mL石油酷(300C600C)横展一次，展至板端过1min，取出通风挥干5min。7.4.3.2 纵展以甲苯乙酸乙醋甲酸(4.12)为纵展剂。将横展挥干后的薄层板置立式展开槽内纵展15cm。取出通风挥干约10min。7.4.4 显影将薄层板(7.4.3)置1300C烘箱中加热7min 10 min
10、，取出后冷却1min5 min后于紫外光灯(5. 12)下观察。7.4.5 观察与评定薄层板经横展后，试料溶液中的DON向右移动约O.7 cml cm，使其摆脱了杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的三个标准品点可分别作为横展后试料榕液中DON点和两个标准品点的定位点。试料溶液中的DON点又可与纵展后的标准品点比较RI值而定位。这样从横向和纵向两个方向确定试料榕液DON点的位置，达到定性的目的。如果在薄层板上与标准荧光斑点对应处未见试料中的被测物斑点，则需按上述方法重新点第二块板。只是在点完试料溶液后，在滴加试料榕液处再滴加1L标准品溶液，与第一块板同样展开、显荧光。如果第二块板上试料溶液加1L
11、标准品溶液所显荧光强度与1L标准溶液相同，则试样中DON含量为阴性或1mg/kg以下。阳性试样可通过稀释试料榕液或调整点样量直至所产生斑点的荧光强度与1L标准品溶液所显荧光强度相同进行定量。虽然基线上的三个DON点在横展中都稍有移动，但对各点荧光强度无影响，两个标准品点均可用于和试料榕液点比较荧光强度。mCON-区的H阁。华人民共和国家标准配合饲料中脱氯雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法GB!T 838 1. 6-2005 国由，* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销4陪印张0.5字数7千字2006年1月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年1月第一版定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)685335334陪书号:155066 1-26928 GB/T 8381.6-2005
