1、ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国农业行业标准NY /T 680-2003 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法2003-07-30发布Enzyme-linked immunosorbent assay for avian leukosis virus p27 antigen 中华人民共和国农业部发布2003-10-01实施613 NY /T 680-2003 前-R 本标准的附录A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人=陈西钊、苏敬良、王宏伟、田克恭、吴清民、王传彬。们1.1 NY /T 680-2003 1
2、 范围禽白血病病毒p27抗原酶联免擅吸附试验方法本标准规定了禽白血病病毒(ALV)p27抗原酶联免疫吸附试验方法u本标准适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡胚组织、细胞培养物中的ALVp27蛋白抗原。2 p27抗原酶联免疫吸附试验2. 1 试验材料2. 1. 1 试剂2. 1. 1.1 抗p27蛋白抗体:应用提纯的禽成髓细胞性臼血病病毒p27蛋白免疫家兔制备。2. 1. 1. 2 阳性抗原z含鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的鸡蛋清。2. 1. 1. 3 阴性抗原z无鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的SPF鸡蛋清。2. 1. 1. 4 酶结合物辣根过氧化物酶标i己的抗p27蛋白抗体。2.
3、1. 1. 5 磷酸盐缓冲液(PBS)，配制见第A.1章。2. 1. 1. 6 包被液2配制见第A.2章。2. 1. 1. 7 洗涤液2配制见第A.3章。2. 1.1. 8 样品稀释液配制见第A.4章。2. 1. 1. 9 底物溶液z配制见第A.6章。2.1. 1. 10 终止液配制见第A.7章。2. 1. 2 器材的酶联检测仪gb) 聚苯乙烯板;c) 微量加样器，容量50L200L;d) 37C恒温培养箱。2. 1. 3 样晶 2. 1. 3.1 鸡蛋样品将待检鸡蛋小的一端朝上放置，打碎蛋壳.用移液器x;菌吸取蛋清，密装于灭菌小瓶内。2. 1. 3. 2 细胞培养物z用移液器元菌吸取细胞培养
4、物.密装于灭菌小瓶内.j飞或30C保存或立即送检。试验前将送检样品统一编号，试验时不做稀释口2.2 操作方法2. 2. 1 用包被液将抗p27蛋白抗体作4000倍稀释，每孔100L阳入96孔聚苯乙烯板中.4C过夜。2.2.2 取出包被好的聚苯乙烯板，将液体倒弃，每孔加250L洗涤液漂洗主次.每次2min.甩干。2.2.3 每孔加150L质量浓度为1%的明胶封闭液，37C反应60mino 2.2.4 重复2.2. 2. 2.2.5 在A，、儿孔各加100L标准阴性对照，儿、A，孔各加10LIJ、准阳性对照。2.2.6 将待检样品加入其他各孔，每个待检样本加两孔.每孔1001.:，反应60min
5、Q 2.2.7 重复2.2.2。2.2.8 每孔加100L工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体.37C反应60min 0 615 NY /T 680-2003 2.2.9 唱主2.2.202. 2. 10 句孔加100l.新配制的底物熔液，室温边光反应10mino 2. 2. 11 倍孔加100L终止液。2. 2. 12 置酶联检测仪于450nm测定各孔吸光度COO)值。2.3 结果判定2. 3. 1 阴性对照。D均值等于(A，孔D值+A，孔。D值)/2;阳性对照。D均值等于(A，孔00值十A，孔OD值)/202.3.2 阴饨对照OD均值小于O.15，阳性对照。D均值减去阴性对照。D
6、均值大fO. 3时试验成立，1j则垂做。2. 3. 3 另/等于(样品孔。D均值阴性对照。D均值)-7 (阳性对照。D均值阴性对照00均值)。待检样本S/P小于等于O.2 lrJ为阴性，表示待检样品中无Al.Vsp27蛋白抗原。待检样中4月/I大于O.2判为阳性.表示待检样品中有AL马，Ts p27蛋白flL隙。( 11 i 附录A(规范性附录)试剂的配制A. 1 磷酸盐缓冲液(PBS.O.Olmol/L pH7. 4) 氯化纳氯化饵磷酸二氢梆l一二水磷酸氢二锅蒸馆水A.2 包被液(0.05mol/L pH9. 6) 碳酸纳碳酸氢$内蒸馆水A.3 洗涤液PHS Tween-20 A.4 样晶稀释液含体积分数10%新生牛血清的洗涤液。A.5 硝酸盐-拧楝酸缓冲液(pH5.0)拧橡酸十二水磷酸氢二纳蒸储水A.6 底物溶液8g 0.2 g 。.2 g 2.83 g 加至1000 mL 1. 59 g 2. 93 g 加至1000 mL 1 000 mL 0.5 mL :l. 26 g 12.9 g 700 mL N￥/T 680-2003 用二甲基亚枫将3355四甲基联苯胶TMHl配成1%的浓度.1飞u存。使用时按下列配方配制底物浴液。磷酸盐拧橡酸缓冲液1 %3了55因甲基联苯胶30%双氧水A.7 终止液硫酸蒸馈水9.9 mL 0.1 mL lL 58 mL 442 mL 617
