1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 44362021 禽白 血病 病毒 与禽 网状 内皮 组织 增殖 病病 毒 联合 净化 技术 规程 Technical regulations for elimination of avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus 2021-11-17 发布 2021-12-17 实施 山 东省市场 监督管理 局 发 布 DB37/T 44362021 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020 标准化工作导则 第1 部分：标 准化文件的 结构和起草 规则的
2、规 定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位： 山东省动物疫病预防与控制中心、 山东农业大学、 山东益生种畜禽股份有限公司。 本文件主要起草人：胡莉萍、成子强、薛婧雯、周德方、陈静、江芳、张心悦。 DB37/T 44362021 1 禽白血 病病毒 与禽网 状内皮 组织增 殖病病 毒联合 净化技 术规程 1 范围 本文件规定 了禽白血病 病毒和禽网 状内皮组织 增殖病病毒 的实验室检 测技术要求 和联合净化 程序。 实验室检测包括抗原的ELISA
3、检测、RT-PCR 检测和 病毒分离鉴定。 本文件适用于原种鸡群、祖代鸡群和父母代种鸡群的净化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 禽白血病病毒与禽网状内皮增殖病病毒实验室检测技术 4.1 器材 高温高压灭菌锅 ( 温度 范围：105 134 ； 额 定压力：0.23 Mpa) 、 离心 机 （转速：2 0
4、00 rpm 14 000 rpm ）、PCR 仪、二 氧化碳恒温细胞培养箱、分光光度计、酶标仪、冰箱。 4.2 材料与试剂 4.2.1 无 RNase 水。 4.2.2 商品化的 ALV 与 REVELISA 抗原检测试剂盒。ALV 和 REVELISA 抗原检测试剂盒均通过检测泄殖 腔拭子， 分别检测 ALV 所有亚群共有的抗原 p27 蛋白， 或REV 的主要免 疫原性蛋白 p30， 从而对ALV 和 REV 的感染情 况进行判定。 4.2.3 商品化的 RNA 提取试剂盒 。 4.2.4 商品化的 RNA 反转录试剂 盒。 4.2.5 PBS 缓冲液：NaCl 8 g ，KCl 0.2
5、 g ，Na2HPO4 1.42 g （Na2HPO412H2O 3.58 g ），KH2P04 0.27 g 溶于蒸馏水，定容为 1 000 mL ，过滤 后高温高压灭菌备用。 4.2.6 细胞生长培养基：商品化的 DMEM 液， 加 10 % 胎 牛血清，青霉素、链霉素各 250 IU/mL ，储存于 4 冰箱备用 。 4.2.7 细胞维持培养基：配制方法同 4.2.6，使用胎牛血清浓度为 1 % 。 4.2.8 ALV-A gp85 、ALV-B gp85 、ALV-J gp85 及 REV gp90 基因片段 的特异性引物，具体引物序列见 附录 A 。 4.2.9 除特别规定外，在检测
6、中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 的要 求。 DB37/T 44362021 2 4.3 样品 4.3.1 血液样品 ： 母鸡翅下静脉抽取 1 mL 静脉血， 制备血清； 公鸡抽取 1 mL 静脉 血， 2 000 rpm 离心， 制备血浆，储存于-20 冰箱备用。 4.3.2 泄殖腔棉拭子样品：用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有 1 mL PBS 缓冲液的离心 管内，1 2000 rpm 离心 2 min 后将上清 等分为 2 份 ，将进行抗原检测的样品储存于-20 冰箱备用，将 进行病毒分离及RNA 提 取的样品储存于-80 冰 箱备用。 检测 样品前，
7、 棉拭 子应反复冻融2 次3 次， 4 ， 1 2000 rpm 离心 2 min 3 min ，吸取上 清。血清样品于室温融化，500 倍稀 释，用于检测。 4.3.3 蛋清样品： 将蛋壳灭菌 后，用镊子 将种蛋钝端 敲破，使用 移液器从破 壳处沿蛋壳 内壁伸入蛋 内 约 1 cm， 吸取 1 mL 蛋清 ，并储存于-20 冰箱备 用。 4.4 病毒抗原的 ELISA 检测 4.4.1 操作方法：采用商品化的 ELISA 试 剂盒检测泄殖腔棉拭子或蛋清。按照试剂盒提供的检测步骤 操作。 4.4.2 结果判定：按试剂盒提供的算法判定。ALV-p27 和 REV-p30 抗原其中之一为阳性，淘汰
8、来源雏 鸡。如两者均可疑或其中之一为可疑，则需进行 RT-PCR 检 测或病毒分离。 4.5 RT-PCR 检测 4.5.1 操作方法 4.5.1.1 RNA 及 cDNA 提取：将冻存于液氮罐内的棉拭子 PBS 溶液用商 品化试剂盒提取 RNA ，用 分光光 度计测浓度后，用商品化试剂盒反转录成 cDNA 。RNA 储存于-80 冰箱，cDNA 储存于-20 冰箱。 4.5.1.2 PCR 及电泳检 测： 完成RNA 提取和将RNA 反转录成cDNA后 ，以 cDNA 为模板， 利 用ALV-A gp85 、 ALV-B gp85 、ALV-J gp85 及 REV gp90 基因片段的特异
9、性引物分别进行 PCR 扩增。扩增产物于 120 V ， 120 mA， 使用 1 % 琼脂糖 凝胶进行电泳检测。剩余的 RNA 保存 于-80 冰 箱，cDNA 保存 于-20 冰 箱。 4.5.2 结果判定 琼脂糖凝胶 电泳中出现ALV-A 特异的1020bp片段、ALV-B 特异的1038bp片段、ALV-J特 异的545 bp片 段或REV 特 异的292 bp 的片 段时，可判定病毒检测阳性。具体反应体系及条件参见附录B 。 4.6 病毒分离 4.6.1 操作方法 4.6.1.1 DF-1 细胞传 代培养： 取生长状态良好的 DF-1 细 胞传代并用细胞生长培养基培养至少 8 h，待
10、 细胞密度达到 60 % 70 % 后用于病毒分离。 4.6.1.2 病毒液感作DF-1 细胞： 在 二氧化碳培养箱培养了至少8 h 的DF-1 细胞弃去 细胞生长培养基， 将 1 mL 棉拭 子样品 PBS 液或 1 mL 血清/ 血浆注入 培养瓶/培 养板/ 培养皿内 ，作用于 DF-1 细胞，将细 胞 放在二氧化碳培养箱内作用 1 h 后更 换细胞维持培养基，培养至少 3 d 。 4.6.1.3 p27/p30 抗原 检测：采用商品化的 ELISA 检测试剂 盒检测。 4.6.2 结果判定 p27 抗原阳性 ，可判定为ALV 感染；p30抗原阳性，可判定REV 感染 。 4.7 结果处理
11、 DB37/T 44362021 3 淘汰泄殖腔 棉拭子ALV-p27与REV-p30均为阳性或 任一为阳性 的鸡只；淘 汰泄殖腔棉 拭子ALV-p27与 REV-p30均为 可疑或任一 为可疑且RT-PCR为阳性的鸡只；淘汰 泄殖腔棉拭 子ALV-p27 与REV-p30均为 可疑 或任一为可疑且病毒分离为阳性的鸡只。 5 养禽场禽白血病与禽网状内皮组织增殖病联合净化程序 在养禽场对禽白血病与禽网状内皮组织增殖病进行联合净化， 需按以下顺序开展净化工作， 依次完 成多个世代的ALV 与REV检测、净化，直至建立阴性禽群。 5.1 孵化室雏鸡检测 5.1.1 操作方法： 检测应从原 种鸡群开始
12、 ，收集鸡群 的种蛋，同 一只种鸡来 源的种蛋放 在一起，分 群 孵化， 采集全部 1 日龄 雏鸡的胎粪， 分别用 ALV-p27 抗原 ELISA 检测试剂 盒检测 p27 抗原， 用 REV-p30 抗原 ELISA 检测试剂盒检测 p30 抗 原。 任一检测中有一只雏鸡为阳性， 则同一种鸡来源的雏鸡均判为阳 性， 淘汰而不作种用。 对选留的阴性雏鸡， 以母鸡为单位， 同一母鸡的雏鸡放于一个笼中隔离饲养 （25 只50 只 ）。 5.1.2 注意事项： 每个笼间不 可直接接触 ，包括避免 直接气流的 对流。饲养 期间要采取 避免横向传 播 的各种措施。接种疫苗时避免共用注射器。 5.2 后
13、备种鸡检测 采集全部5周6 周龄鸡血 清和泄殖腔棉拭子， 分离培养ALV 和REV 。 选出阴 性鸡， 隔离饲养， 作为 后 备种鸡。 5.3 种鸡开产初期检测 开产初期， 每只鸡取2 枚3 枚蛋， 取蛋清的混合样品， 使用ALV-p27 抗原ELISA 检测试剂盒 检测蛋 清 中的p27 抗原 ，使用REV-p30 抗原ELISA试剂盒检测蛋清中的p30抗原。淘汰抗原阳性鸡。 5.4 20 周25 周龄留种前检测 每只鸡取2枚3 枚蛋对蛋 清进行p27 、p30 抗原检测 ， 淘汰阳性鸡。 原则同上。 公鸡则采集血浆接 种 DF-1 细胞分 离病毒，淘汰阳性种蛋。 5.5 种蛋的选留和孵化
14、在经8.4 步留 种前检测淘汰阳性鸡后， 每只母鸡仅选用1 只检测 阴性公鸡的精液授精。 按规定时间留 足种蛋， 每只母鸡的种蛋均标号。 在出壳前， 将每只母鸡的种蛋置于同一标母鸡号的专用纸袋中， 置于 出雏箱中出雏。 5.6 第二世代鸡的检测淘汰 经上述8.18.5的检测淘 汰后种鸡的 出壳的雏鸡 ，作为净化 后第二代鸡 。继续按8.1 8.5的程序， 实施第二世代的检测和净化。第三世代后可按此程序继续循环进行。 5.7 公鸡检测程序 5.7.1 孵化室 1 日 龄雏鸡检测，同母鸡（先收集胎粪一次，再鉴别雌雄）。 5.7.2 第一次挑选 公鸡时，采 集血浆进行 病毒分离检 测。在开始 供精之
15、前， 至少经过病 毒分离检测 一 次。 DB37/T 44362021 4 5.7.3 在生产阶段采血浆进行病毒分离检测一次。 5.7.4 每 6 个月抽 检血清样品，监测 p27 抗原和 p30 抗原。 5.8 净化标准 连续进行多个世代种鸡的ALV 与REV检测与净化， 病原学抽检， 原种场全部为阴性， 祖代场和父母代 场阳性率低于1 % ； 血清 学抽检，A/B亚群抗体和J 亚群抗体 （采用商品化的ELISA 检测 试剂盒检测） ， 原 种场全部为 阴性，祖代 场和父母代 场阳性率低 于1 % ；连续两年以上无 临床病例； 即为达到禽 白血病与 禽网状内皮组织增殖病净化状态。 5.9 耗
16、材的无害化处理 检测阳性 的 鸡和所有 用 毕的耗材 见 病死及 病 害动物无 害 化处理技 术 规范（ 农 医发2017 25 号）。 DB37/T 44362021 5 A A 附录A （资料性） RT-PCR 引物信息 禽白血病病毒（ALV ）与 网状内皮增殖病病毒（REV ）RT-PCR检测所需引物序列。 引物浓度均为10 pmol。 表A.1 ALV 与 REV RT-PCR 检测所需引物序列、产物长度、扩增目的及其用途 病毒 引物名称 序列 长度 扩增目的 用途 ALV-A 上游引物 5-CGCGGATCCGATGTTCACTTACTCGAGC-3 1020bp 禽白血病病毒A 亚
17、群（ALV-A） gp85 基因片段 扩增出的gp85 特 异性片段进行琼脂 糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CGCTGCAGTCGTTTACGTCTTATACCTG-3 ALV-B 上游引物 5-CGCTGCAGGATGTCCACTTACTCGAGCA-3 1038bp 禽白血病病毒B 亚群（ALV-B） gp85 基因片段 扩增出的gp85 特 异性片段进行琼脂 糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CCGAAGCTTTCGTTTGCGTCTTATACCTG-3 ALV-J 上游引物 5-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 545bp 禽白血病病毒J 亚群（ALV-J） gp85 基因片段
18、 扩增出的gp85 特 异性片段进行琼脂 糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 REV 上游引物 F: 5-CATACTGGAGCCAATGGTT -3 292bp 网状内皮增殖 病病毒（REV） gp90 基因片段 扩增出的gp90 特 异性片段进行琼脂 糖凝胶电泳检测 下游引物 5-AATGTTGTAGCGAAGTACT -3 DB37/T 44362021 6 B B 附录B （资料性） RT-PCR 反应条件 B.1 反转录体系为：采用 20 L 体系， 在 PCR 管中 依次加入 5X FastKing-RT SuperMix 4 L ，模 板
19、RNA x L （x=2 000/RNA 浓度） ，用 RNase Free ddH2O 补足 20 L ，使用 42 15 min ，95 3 min 的 条件进行反转录。 B.2 PCR 反应体系 为：反应总体系为 25 L ，在 PCR 管 中依次加入，2Tap PCR MasterMix12.5 L ， 10 pmol/ L 的上下游引物各 0.5 L ，模板 cDNA1 L ，其余 用 RNase Free ddH2O 补至 25 L 。 循环条件 （ALV）：95 预变性5 min，94 变性30 s ，53 退火30 s ，72 延伸40 s，进 行35个循 环，最后于72 延伸10 min 。4 保存 。反应后，PCR 产物取7 L 8 L ，在1 %琼脂糖凝 胶电泳检测。 图B.1 ALV-J PCR 扩增电泳结果 循环条件 （REV）：95 预变性5 min，94 变性30 s ，53 退火30 s ，72 延伸40 s，进 行35个循 环， 最后于72 延伸10 min 。4 保存 。 反应后，PCR 产物取7 L 8 L，在1 % 琼脂糖凝胶 电泳检测 。 图B.2 REV PCR 扩增电泳结果 DB37/T 44362021 7 参考文 献 1 病死 及病害动物无害化处理技术规范（农医发2017 25 号）
