1、ICS 11 .020 c59 23226-2008 引TS中华人民共和国卫生行业标准ws 285-2008 流行性感冒诊断标准Diagnostic criteria for influenza 2008-02-28发布2008-09-01实施e 兰兰兰主叶=-1主只、岳三主乓不口IE-=r主组主音白发布标准搜搜网w附.bzsos口.corn各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 目次前言田1 范围2 术语和定义-3 诊断依据4 诊断原则.5 诊断26 鉴别诊断2附录A(规范性附录)流感病毒分离培养和鉴定方法 3 附录B(规范性附录)红细胞凝集抑制试验.14 附录规范性附录)微量中和试
2、验附录D(规范性附录)流感病毒核酸检测方法.21 附录k规范性附录)免疫荧光法检测方法m附录k资料性附录)流行性感冒病原学、流行病学和临床表现.27 附录G(资料性附录)流感标本的采集、运送和处理规程.29 标准搜搜网w附.bzsos口.corn各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 目。吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。根据国家质检总局国家标准委公告(2005年第146号), GB 15994-1995(流行性感冒诊断标准及处理原则自本标准实施之日起废止。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E是规范性附录，附录F、附录G是资料性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员
3、会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人:舒跃龙、郭元吉、余宏杰、张烨、徐翠玲。标准搜搜网阳w.bzsoso.corn各类标准行业资料免费下载田ws 285-2008 流行性感冒诊断标准1 范围本标准规定了流行性感冒的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构和人员对流行性感冒进行诊断、报告。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 流感病毒分型type of influenza virus 根据流感病毒核蛋白(NP)、Ml蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。
4、2.2 甲型流感病毒亚型subtype of influenza A virus 甲型流感病毒根据其表面的血凝素(H或称为HA)、神经氨酸酶(N或称为NA)抗原和基因特性的不同又可分为多个亚型。至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1H16)，神经氨酸酶有9个亚型(N1N9)。2. 3 流感样病例influenza-like iIIness 发热，伴咳嗽或咽痛之一者。3 诊断侬据3. 1 流行病学史在当地流行季节(如我国北方的冬春季，南方的冬春季和夏季)，一个单位或地区集中出现大量上呼吸道感染患者，或医院门诊、急诊上呼吸道感染患者明显增加。3.2 临床表现3.2.1 通常表现为急起高热
5、(腋下体温二三380C)、畏寒、头痛、头晕、浑身酸痛、乏力等中毒症状及咽痛、干咳等呼吸道症状，但卡他性症状常不明显。3.2.2 少数病例有食欲减退，伴有腹痛、腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。3.2.3 少数病例也可并发鼻窦炎、中耳炎、喉炎、支气管炎、肺炎等，甚至会呼吸循环衰竭而死亡。3.2.4 在两岁以下的幼儿，或原有慢性基础疾病者，两肺可有呼吸音减低、湿眼音或哮呜音，但无肺实变体征。3.2.5 重症患者胸部X射线检查可显示单侧或双侧肺实质性病变，少数可伴有胸腔积液等。3.2.6 外周血象白细胞总数不高或偏低，淋巴细胞相对增加，重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞下降。3. 3 实验室检查流感标本的
6、采集、运送和处理规程参见附录G。3.3. 1 从患者呼吸道标本中分离和鉴定到流感病毒(见附录A)。3.3.2 患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上(见附录B和附录。3.3.3 在患者呼吸道标本流感病毒特异的核酸检测阳性(见附录D)或检测出特异的抗原(见附录E)。3.3.4 采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，流感病毒特异的核酸检测阳性(详见附录D)或检测出特异的抗原(见附录E)。4 诊断原则如果在非流行季节仅根据临床表现，流感很难与其他病原体，尤其呼吸道病原体导致的疾病区别，1 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 对流感病例的
7、确诊往往需要实验室的诊断依据。但在流感流行季节，当地一个单位或局部地区出现大量上呼吸道感染患者或医院门诊、急诊上呼吸道感染患者明显增加时，具备相应临床表现的可作为流感临床诊断病例。流行性感冒病原学、流行病学和临床表现参见附录F。5诊断5. 1 临床诊断病例具备3.1和3.2中任何一项临床表现者。5.2 确诊病例5. 2.1 流感样病例并具备3.3中的任何一项者。5.2.2 临床诊断病例并具备3.3中的任何一项者。6 鉴别诊断在体征上很难与多种病毒如呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒等引起的上呼吸道感染进行鉴别，鉴别诊断主要依靠病原学、特异核酸检查和血清抗体测定。2 标准搜搜网
8、www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 附录A(规范性附录)流感病毒分离培养和鉴定方法A.1 病毒的分离培养流感病毒的分离培养主要采用MDCK细胞和鸡胚培养方法分离病毒，具体技术如下:A. 1. 1 MDCK细胞分离病毒方法A. 1. 1. 1 MDCK细胞培养技术A. 1. 1. 1. 1 生物安全级别和生MDCK细胞培养实验生物安全实验室相应的生物安全规定。A. 1. 1. 1. 2 细胞培养a)生长成片的保存于一200C;e) HEPES f)胎牛血i) 1mL、10j) 70%7 建议:要求2) HEPES 3) 7.5%牛血b)细胞生长液胎牛血清1
9、0mL加到9A. 1. 1. 1.4 MDCK细胞的培这里以下75细胞瓶的单层MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。a)首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37C水浴中预热的EDTA-膜酶。b)温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA膜酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA膜酶。c)重新加人5mL在37C水浴中预热的EDTA-膜酶重复上述步骤。d)加人1mLEDTA膜酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37C孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离(5min10min)。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加人1mL胎牛血清灭活残余的膜酶。e)加9mL已经配制好的含有L谷氨酸的D-M
10、EM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。3 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 f)取10mL混合物加到90mL细胞生长液(细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞)。g)每个T-25细胞培养瓶加入6mLC6X 105 /mL)细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T-75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2d3d可生长成片(80%90%)的单层细胞。h)于370C培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。A. 1. 1. 1.5 MDCK细胞计数方法用血细胞计数板来精确计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。a)在0.2mL中台盼蓝(0.1%PBS
11、溶液)中加入0.2mL细胞悬液，混匀。没有活性的细胞被染成蓝色。b)取适量的细胞悬液分两边加人血细胞计数器的计数室。c)计算计数室囚个角上三线包围的正方形中的活细胞，压线的细胞不计数。d)如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。e)计算计数室4个角上正方形内的活细胞总数。f)用式(A.1)计算每毫升悬液中活细胞的数量。C=TXTbX1/4X104 CA. 1) C一一每毫升内原始细胞数;T一-4个角上正方形内的活细胞数;Tb 台盼蓝的稀释度校正值(稀释度计算为l/Tb)。g)计算稀释系数。h)用稀释液将细胞稀释到所需的细胞工作浓度。A. 1. 1. 1.6 细胞的冻存a)细胞
12、冻存材料1)已经生长成片的MDCK细胞:80%90%成片，细胞生长良好存活率高;2)二甲基亚枫CDMSO);3)胎牛血清;4) EDTA膜酶(0.05%膜酶;O. 53mmol/L EDT A-4Na) ; 5)移液管:lmL、10mL。b)细胞冻存步骤1)冻存液的配置:9mL胎牛血清、1mL二甲基亚矶;2)细胞消化:消化过程见A.1.1.1.4中的a)b); 3)细胞消化后，加入配置好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内;4)细胞冻存浓度为1X106/mL;5)细胞冻存过程:40C2h，一200C拙，放人液氮长期保存。A. 1. 1. 1. 7 细胞的复苏冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免
13、冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞凋亡。细胞活化后，需要数日或继续传一至二代，其细胞特性才会恢复正常。4 a)材料1) 3rc恒温水浴箱;2)细胞生长液:配置方法同A.1.1. 1. 3中的b); 3) 70%75%的酒精;4)移液管:lmL、10mL。b)细胞复苏步骤1)将细胞生长液放人370C7j(浴预热，预热后以70%75%的乙醇擦拭外壁后放人生物安全柜内;标准搜搜网WWTAT.bzsoso. corn各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 2)自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉;3)立即放入3rc水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全
14、部融化，以70%75%的乙醇擦拭保存管外部，移人生物安全柜内;的取出1.0mL解冻的细胞冻存悬液，缓慢加人事先加好5mL生长液的T-25细胞培养瓶内，混合均匀，放人3rc培养箱培养;5)次日，观察细胞形态，并且更换细胞生长液。A. 1. 1. 1.8 孔1DCK细胞系的敏感性的检测在过量传代的情况下，MDCK细胞可能会失去其对呼吸道病毒的敏感性。因此实验室应保持低代数的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传15代20代，达到40代以上时，需要进行敏感性测定，测定时选择己知TCID50的病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用
15、细胞系应确保无支原体等污染。选择己知TCID50的流感病毒，在同一条件下分别感染早代(小于30代)的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID50测定。如果测试的TCID50比早代的低2个或以上19，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用;如果两者相差不超出一个19，表明可继续使用。A. 1. 1.2 流感病毒的MDCK细胞分离标准操作规程A. 1. 1.2.1 试验材料a)已经75%90%成片的MDCK细胞，选用T-25大小的细胞培养瓶来用作病毒分离;b) TPCK处理膜酶(牛膜腺来源咽型); c) HEPES缓冲液，1mol/L母液;d) D-MEM培养基、Hanks液;e)青霉素、链霉素母
16、液(10000U/mL青霉素;10 000g/mL硫酸链霉素); f)牛血清白蛋白组分V，7.5%溶液;g)临床样品0.5mLC标本的采集及处理方法参见附录G);h) 1mL无菌移液管;i) 10mL无菌移液管。A.1. 1. 2. 2 培养液和试剂的准备(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)a)细胞维持液500mL D-MEM液中加人:1)青霉素、链霉素母液5mLC终浓度达:100U/mL青霉素;100g/mL链霉素); 2)牛血清白蛋白组分V12. 5mLC终浓度:0.2%);3) HEPES缓冲液12.5mLC终浓度:25mmol/L)。b)病毒生长液每500mL细胞维持液中加人0.5m
17、L的TPCK-膜酶(母液浓度为2mg/mL)使TPCK膜酶的终浓度为2g/mL。A. 1. 1.2.3 流感病毒细胞分离程序所有有关流感病毒分离的操作都应在生物安全H实验室中的生物安全柜里进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。a) 75%90%成片细胞的准备1)用40倍物镜镜观察细胞生长状态。选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。2)轻轻倒出细胞生长液，用6mLHanks液分别清洗细胞3遍。b)细胞培养瓶的接种1)用无菌的移液管将清洗细胞的Ha此s液从细胞培养瓶中移出;2)用无菌的移液管吸取200L临床样品置于细胞培养瓶中，温和摇动数次;5 标准搜搜网ww
18、w.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 3) 3rC培养箱中吸附lh2h;4)吸出接种物，用Hanks液清洗细胞，清洗2次，然加人6mL含2g/mLTPCK-膜酶的病毒生长液于细胞培养瓶中;5)放置于330C350C培养箱培养;的每日观察细胞病变情况(细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大;细胞核固缩或破裂;严重时细胞部分或全部脱落)。c)细胞培养物的收获1)当75%100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞冻融1次2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细病变啻在该牙_7天收获。2)进行红细胞凝集试验?哇哇8的甲子病毒的鞍马体方法参见流感病毒的鉴定技
19、术c) 70%7 d)一次性的鸡卵开孔f)融化的g) 10mL管h) 10mL移液。无菌慑子。续盲传1次2次。HA试关规定进行处理。对于的鉴定。连续传代2方法进行核酸时应将病毒液进行关。一般滴度小A. 1.2.2 流感病毒鸡所有有关病毒分离严格执行标准操作规程防护要求。，必须遵守生物安全规定，循生物安全实验室的个人A.1.2.2.1 验卵a)用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室写东囊的专弄限、胚胎的位置。b)如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉。c)如何判断鸡胚状态1)血管:活胚血管清晰;死胚模糊，成淤血带或淤血块。2)胎动:活胚有明显的自然运动，但是大于14d
20、后胎动则不明显;死胚无胎动。3)绒毛尿囊膜发育界限:密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。A.1.2.2.2 鸡胚接种6 a)将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。b)用70%75%乙醇消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10mmX6mm裂口。标准搜搜网w附.bzsos口.corn各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 c)用注射器吸200L处理过的临床标本，装上16号针头。d)从裂口中滴人元菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层(脏层)铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺人胚胎的膊下胸前，用针头轻轻拨动下腾
21、及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100f.LL临床标本。将针头退出至1/2寸，将另外100L临床标本注入鸡胚尿囊腔。e)用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外两枚鸡胚。f)将针头弃于合适的生物安全装置中。g)用消毒过的医用胶布封口。h) 330C350C温箱培养鸡胚2小划。h.寸，蝠主革养2d，B型流感病毒培养划，呼吸道标本标本培养3d。鸡胚进行病毒押;路时，每天检查理胆也长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是s A. 2.1.1 生物安全要求生物安全要求及个人防护要求与流感病毒的分离相同，并应遵守相应的生物安全规定。A.2. 1.2 实验材料A.2.1.2.1 当
22、时人群中流行的流感病毒如A(H1N1)、A(H3N2)、B型流感病毒的标准参照抗原与参照血清。A. 2. 1.2.2 缓冲液和其他试剂a)红细胞悬液(鸡、火鸡、豚鼠、或人0型红细胞，由于0相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞或人0型红细胞)。b)磷酸缓冲液(PB曰:0.01mol/L. pH7. 2。7 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 c)生理盐水。d)其他1) 3rc水浴;2) 560C水浴;3)台式离心机;4)多道可调加样器;5)离心管;的96孔微量板:鸡、火鸡红细胞选择V型底微量板;豚鼠和人0型红细胞选择
23、U型底微量板。A. 2.1.3 试剂配制a)磷酸缓冲液(PB曰:0.01mol/L, pH7. 20 25X倍PBS母液:2.74g Na2HP04 ,0. 79g NaH2P04加去离子水至100mL。b)工作液配制:25倍PBS缓冲液完全溶解后，取40mL25倍PBS液，加人8.5g NaCl，加去离子至1000mL。用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整pH至7.201210C高压灭菌15min，消毒后至40C保存。c)生理盐水:0.85%NaCl。20X母液:170g NaCl加入1000mL去离子水，1210C高压灭菌15min，消毒后至40C保存。生理盐水(0.85%):2
24、0X母液50mL加入去离子水950mL。1210C高压灭菌15min，消毒后至40C保存。d)阿氏液配制1) 25g葡萄糖;2) 8. 5g拘橡酸铀;3) 4. 5g NaCl; 的O.55g构橡酸。加去离子水1000mL，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整pH至6.1，用O.22m的细菌滤器过滤，或1210C高压灭菌30min，消毒后至40C保存。A. 2.1.4 红细胞悬液配制a)取阿氏液中的红细胞，1200r/min离心5min，弃上清。b)加人至少10倍沉淀物的PBS液体洗涤，充分棍匀，1200r/min离心5m巾，弃上清。c) PBS液体按以上方法洗涤三次。最后一次洗涤后
25、，1200r/min离心10minod)将红细胞加入到合适的PBS中，稀释至合适的浓度，通常为1mL红细胞加入到99mLPBS中0%)。火鸡、鸡的红细胞，实验终浓度一般为0.5%，如用人0型、豚鼠红细胞，终浓度为0.75%。使用不同类型红细胞进行红细胞凝集试验各项条件比较见表A.1。表A.1流感病毒红细胞;疑集试验各项条件红细胞鸡火鸡终浓度O. 5 O. 5 孔底部形状V型V型孵育时间30min 30min 细胞对照细胞沉积成点状，倾斜时细胞细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状向下流成泪滴状A.2. 1.5 流感病毒红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验操作步骤A. 2. 1. 5. 1 . RD
26、E(受体破坏酶)处理标准参照血清8 豚鼠O. 75 U型60min 细胞沉积成环状标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载人0型血O. 75 U型60min 细胞阳环状ws 285-2008 a) 1份血清加入4份RDE，混合;b) 370C水浴过夜;c) 560C水浴加热30min，灭活RDE的活性。A.2. 1.5.2 处理后血清中有无残留非特异性凝集素a)选用适当的微量板，从B1至H6中加入25LPBS;b) A1到A5各加50L处理后的血清，A6加50LPBS;c)用多道加样器从A1行开始，各孔取25L血清，由A行至H行进行2倍稀释血清;d) H行各孔稀释混匀后其
27、取25L;e)每孔补加25LPBS;f)每孔加入50L红细胞悬液，混匀;g)置室温(220C25 OC) 30min60min，观察有无凝集，如出现凝集则表示血清中有残余的非特异性凝集素。该血清必须用红细胞吸附去除非特异性凝集素后才能使用。A. 2.1.5.3 红细胞吸附去除非特异性凝集素a) 1体积的红细胞可以去除20倍体积的RDE处理过的血清;b)红细胞与血清混匀后，置40C，lh;c) 1 200r/min离心10min;d)小心吸取上清液;e)重复操作直至血清中的非特异性凝集素被去除。A.2. 1. 5. 4 红细胞凝集试验(HA)检测待检病毒滴度a)据所用的红细胞种类选用适当的微量板
28、。将微量板横向放置:垂直方向称列，如孔A1H1称为第一列;平行方向称行，如A1A12称为A行。b)除第一列各孔外(A1H1)，其余每孔加50LPBS。c) A1G1各加100L标准抗原或待检病毒。H1加100LPBS作为红细胞对照。d)用多道加样器从第一列各孔分别取50L病毒液，由第一列至第12列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50L。e)每孔加人50L红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。f)室温孵育30min60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。g)红细胞完全凝集以十气己录;只有部分红细胞凝集记录为+/一;元凝集记录。红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀
29、释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。A.2.1.5.5 制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原a)一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位(指25L体积中含有4个红细胞凝集单位)的病毒量。b)制备4个红细胞凝集凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25L抗原，那么测定一份血清须O.2mL抗原。根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。c)计算出病毒稀释度。用病毒红细胞凝集滴度(HA滴度除以8，得到的商即为4个红细胞凝集单位的稀释度。如，某病毒的
30、HA滴度为64，除以8等于8。按1: 8(lmL病毒液加7mLPBS) 稀释该病毒即可得到4个凝集单位的病毒量/25L的抗原病毒量。d)为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个凝集单位抗原须复核滴定:取50L稀释好的抗原，用等量PBS做2倍系列稀释(同病毒滴定)后加入50L红细胞悬液，至室温孵育30min60min后观察凝集结果。如只有前4孔出现凝集，表明每50L病毒含有8个凝集单位(即25L中含有4个红细胞凝集)，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝9 标准搜搜网阳w.bzsoso.corn各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 集抑制试验。如第5孔也出现凝集，
31、说明每50L病毒含有16个凝集单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50L病毒仅含有4个凝集单位，病毒量须要加倍。此外，4个凝集单位抗原必须每次用前新配制。A. 2. 1. 5. 6 红细胞凝集抑制试验(HD鉴定未知病毒根据所用的红细胞选用适当的微量板a)除A行外，每孔各加25LPBS o A5，A6各加50LPBS作为阴性对照。b)常用的4种抗血清1)抗A(H1N1)亚型血清;2)抗A(H3N2)亚型血清;f) A7至H10g)对照孔(Ah)混匀，至i)取另一块当特定的抗制效价是指抑制红细胞凝集抑制品也原性变异情况。b)孵育时间准确，有些病刮孵育时间来此类问题;c)红细胞悬液的配
32、制必须标准化;d)正确存放试剂，避免反复冻融及污染;e)冻干的试剂应按照说明溶解，保存。A.2.1. 5.8 红细胞凝集抑制试验的对照a)红细胞对照;b)阴性对照血清，以防其他非特异性抗体的影响;c)标准血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素的干扰;d)详细记录实验过程。A.2.1.5.9 红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验的其他限制因素10 标准搜搜网w附.bzsos口.corn各类标准行业资料免费下载A. 2. 2 流感病毒楠经病毒神经氨酸0-半乳糖胶间流感病毒神经氨1)自由的11的用有机陆jJf且可确神经氨酸酶、凶，NI测定已经A、型划分的主要依据测定不受血清中非棋弊端，在流感病毒鉴)了，因重
33、配株NA抗原为A. 2. 2.1 实验材料ws 285- 2008 寺异性抑制素。非特异性抑制素实。这些民似受体的多糖类物质能与病毒白底物中释放。b)胎蛋白:用蒸馆水将融解胎蛋白配成48mg/mL50mg/mL的溶液。c)过腆酸盐试剂:4.28g过腆酸铀榕于38mL去离子水中，加人62mL浓磷酸，充分?昆合，存于棕色玻璃瓶中。d)碑试剂:lOg亚呻酸铀和7.1g无水硫酸铀溶于lOOmL去离子水中，加入O.3mL浓硫酸。e)硫代巴比妥酸试剂:1. 2g硫代巴比妥酸和1.4g无水硫酸铀加人200mL去离子水，沸水中加热溶解，用前新配置，使用期限为一周。11 标准搜搜网www.bzsos口.com各
34、类标准行业资料免费下载ws 285-2008 f)生理盐水:o. 85g NaCl加人100mL去离子水溶解，置室温保存。g)酸化正丁醇试剂:100mL正丁醇中加人5mL浓盐酸，保存棕色瓶中室温保存。A. 2. 2.2 神经氨酸酶活性及活性抑制试验操作步骤A. 2. 2. 2. 1 神经氨酸酶活性测定a)病毒溶液用生理盐水作倍比稀释，一般新鲜尿囊液抗原作1: 21 : 32稀释。稀释好的病毒，每个稀释度50L每管，在底物对照管中加入50L生理盐水。b)每个试管加人50LPBS CpH5. 9)混匀，每管中加人100L底物溶液(胎蛋白)，充分棍匀后37C水浴16h18h。c)从水浴中取出试管，放
35、置室温冷却，每管中加入100L过腆酸盐试剂，充分混合，置室温20mi口。d)每管中加人1mL碑试剂。由于腆的释放出现棕色，摇荡试管使棕色消失呈现乳白色，必要时试验可以在此步骤暂停，测定物置40C冰箱保存。其余测定步骤不能暂停。e)每管中加入2.5mL硫代巴比妥酸试剂，充分混匀。该试剂需在煮沸溶解时加人试管中。f)立即将试管放置到煮沸的水浴中煮沸15min，此时出现红色即为神经氨酸酶活性反应。g)将试管置冰水中冷却，然后加人4mL酸化的正丁醇，塞上干净的橡皮塞，剧烈震荡1min2min，使红色转移到有机层。h) 1 500r/min离心5min，上层达到透亮不混浊。i)分光光度计波长调至549n
36、m，用底物对照管调整零点，然后，从高稀释度到低稀释度，将管中的上层搭液吸置透光池中，依次测出并记录它们的吸光度A值(光密度OD值)，A值越高表明活性越强。j)一个酶活性单位的确定:一般将A值为O.450. 85的病毒稀释度作为一个酶单位。我们将A值O.5的病毒稀释度为一个酶单位，用于酶活性抑制测定。一个酶单位的确定方法如下:取一张半对数坐标纸，其纵轴(对数)表示病毒的稀释度，横轴(算术)表示吸光度。将所得的A值标在相应的位置上，在A值O.5处附近找出4个点，其中2个点A值大于0.5，2个A值小于O.5。依据这4个点作一条直线，这条直线要使它的一侧点至其垂直线的平均值与另一侧点到其垂直线的平均值
37、相等。找出A值相O.5相对应的纵轴的值，这一值就是一个酶单位的稀释度。A. 2. 2. 2. 2 神经氨酸酶活性抑制测定a)测定血清作0.51g稀释，每个稀释度取50L于试管中，并作正常血清对照组。b)将已经测定的病毒抗原用生理盐水配置成一个酶单位，加人测定血清中，50L/管。混匀，370C水浴孵育1h。c)从水浴中取出试管，在每个试管中加入100.uL底物溶液，1昆匀，37C水浴16h18h。d)从水浴中取出试管，接下步骤同活性测定的c)i)步。测定吸光度时从低血清稀释度向高稀释度测定。e)计算血清对神经氨酸酶活性抑制效价。根据测定血清与正常血清两组的测定结果，求出每组血清同一稀释度A值的商
38、数，即为经血清作用以后所剩的酶活性百分数。酶活性计算见式CA. 2) : 每一稀释度(如1: 10)血清+病毒的A值. (A. 2) 同一稀释度(1: 10)正常血清+病毒的A值f)血清效价是能抑制50%的酶活性的最高血清稀释度的倒数。它的确定方法如下:取半对数坐标纸，纵轴(对数)表示血清稀释度，横轴(算术)表示剩下的神经氨酸酶活性的百分数。将5步得到的数值放在坐标纸上相应的位置。从活性50%处划一条与纵坐标平行的直线，在50%酶活性处找出3个4个点，使其中1点2点剩余酶活性不到50%，而其他1点2点剩余酶活性大于50%，在这3个4个点中划一条直线，同样使这条直线一侧的1点2点至直线垂直线的平
39、均值与另一侧的垂直线的平均值相等。与50%剩余酶活性相对应的纵坐标的点所表示的，即使该血清神经氨酸12 标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 酶抑制效价。注:对流感病毒株鉴定时，对阳性血清常用200mrnol/L，pH5. 9的PBS进行倍比稀释，一般从1: 10开始，用量100L每管，这样加上100L抗原和100L底物总量为300L/管，与标准的200L/管有出入，但对定性影响不大;正常对照血清不用同型免疫血清替代;结果用肉眼判断，不测A值;至于血凝素抗体空间干扰问题，一般情况下不加以重视，因为它的干扰程度约为10%，免疫血清抑制效价多为1 :
40、 640左右，这样当NI注40时判断为阳性，一般就不受空间干扰影响了。对重要的流感病毒株鉴定时需要用单价的抗血清进行鉴定。13 标准搜搜网w附.bzsos口.corn各类标准行业资料免费下载ws 285-2008 附录B(规范性附录)红细胞凝集抑制试验B. 1 生物安全要求生物安全级别:二级。B.2 实验材料1 A A(HINl)亚型代表毒A(H3N2)亚型代表c)按以下)11Al:待检血JA2:待检血标A3:待检血汗.-A4:待检血国I1lA5:待检血同rl.A6:待检血清标A7:待检血清书A8:待检血清拍、A9:A(HINl)亚AIO:A(H3N2)亚笠剖刀、最后25LoU红细胞凝集抑制试
41、验板:每孔加人buf)血清对照板每孔加入25LPBS。g)轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。h)室温孵育15min。i)每孔加入50L红细胞悬液，混匀。j)室温孵育30min60min。k)观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。标准搜搜阿阳刚进行2倍稀释血清，弃去H行 ws 285-2008 病毒微量中和试阳抑制病毒感染b)血清样品:包括待检部队J需RDE处理。200Cf、c) MDCK细胞和细胞培养液试剂唱唱唱MDCK细胞:低代数的MDCK细胞(小附录C(规范性附录)微量中和试验MDCK细胞培养液:D-MEM十5%胎牛血清+抗生素500mL D-MEM培养液5.5mL 25.5
42、mL EDTA膜酶d)其他青霉素、链霉素母液(10000U/mL青霉素;10 000g/mL硫酸链霉素)胎牛血清，40nm滤过1)平底96孔微量培养板。2)病毒稀释液:DMEM十1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载15 ws 285-2008 429mL DMEM 66mL 7.5%牛血清白蛋白CBSA)5mL 稀释倍数抗生素3) TPCK膜酶(使用浓度为2mg/mL)。的固定液:80%的丙酬，即配即用，40C保存。400mL 丙酣100mL PBS,pH7.2 C. 3. 2 ELISA实验材料a)抗体1:鼠抗流感病毒甲型核蛋白单
43、克隆抗体。b)抗体2:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGoc)洗涤液:PBS+0.05%吐温-20。4mL PBS, pH7. 2 2mL 吐温20d)封闭液:PBS+0.1%牛血清白蛋白十0.5%吐温-20。867mL PBS,PH7.2 132mL 牛血清白蛋白1mL 吐温-20e)底物和底物溶液。常用的辣根过氧化物酶CHRP)所用的底物为联苯二胶COPD)底物溶液为pH5.0磷酸盐-拘橡酸缓冲液Co. 05mol/L) 底物和底物溶液:10mgOPD 20mg拘橡酸缓冲液(含0.015%过氧化氢水溶液)即配即用f)磷酸盐-拘橡酸缓冲液，pH5.0。58. 8g拘橡酸三铀1L 蒸馆水用盐酸调
44、节pH为5.。加0.015%双氧水(临用前加人)g)终止反应液:1mol/L硫酸C28mL浓硫酸+lL蒸馆水)。C. 4 质量控制病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和试验结果。因此，需对中和试验的整个过程进行质量控制。每次测定必须设立阴性和阳性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行测定。C. 4.1 血清对照血清中含有(阳性对照)或不含有(阴性对照)对测定病毒的特异性中和抗体。血清对照一般分装成多份，-20oC保存，并且避免反复冻融使用。a)血清阴性对照:1)阴性一般来自于与待检血清年龄相同的正常人群，该人群
45、未曾暴露于待检病毒;2)测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释度。b)血清阳性对照:人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。C. 4. 2 病毒和细胞对照16 a)阳性和阴性细胞对照:一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量C100 TCIDso)的病毒进行泪合培养。同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病标准搜搜网www.bzsos口.com各类标准行业资料免费下载毒稀释液进行混合培养。阳性细胞对照:50L病毒稀释液十50L病毒+100LMDCK细胞。阴性细胞对照:100p.L病毒稀释液十100LMDCK细胞。ws 285-2008 b)病毒工
46、作液滴度检查:一般第1孔加入含有200TCID50的100L病毒液，然后进行2倍稀释，再与MDCK细胞进行混合培养。病毒滴度检查:50L2倍系列稀释病毒液(第1孔为100TCID50)十50L病毒稀释液+100LMDCK细胞C1.5X104细胞/孔)。C. 5 微量中和试验操作步骤C. 5. 1 病毒滴度的测定(组织细胞半数感染量TCID50滴定)C. 5. 1. 1 流感病毒的制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，通过红细胞凝集试验测定病毒的存在，分装后700C冻存。C. 5. 1.2 病毒的稀释取1管冻存病毒尿囊液，1: 100稀释。第一排孔加人146L1 : 100稀释过的病
47、毒液，然后做系列半对数稀释，使之成为10-2、10-2.5、10-3、10-3.510-7。每孔含有100L病毒液，每个稀释度重复4孔。人流感病毒一般在膜酶存在的条件下才能感染队在DCK细胞，因此病毒稀释液中需加人终浓度为2g/mL TPCK-膜酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无膜酶存在条件下即可感染孔1DCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有膜酶的两种稀释液，以获得最佳结果。C. 5.1.3 MDCK细胞的准备使用前2d将MDCK细胞1: 10传代，使之70%90%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高(大于25代)将使细胞对病毒的敏感性降低。弃去细胞培养液，用5mLEDTA膜酶洗细胞一次，然后弃去。加4mL5mLEDTA-膜酶覆盖细胞(162cm2的细胞培养瓶)37C培养箱中消化10min20min。待细胞开始脱落时，加人5mL10mL岛1DCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转人离心管，2000r/min离心5min，用PBS洗涤2次，以除去牛血清。将细胞悬浮于1mL病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，加病毒稀释液至10mL，用细胞计数板计数细胞数量。用病毒稀释液将细胞稀释成1.5X
