1、GB 15994 1995 前言流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过空气飞沫传播。流感病毒有甲、乙、丙三个型，其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重，乙型常引起爆发，内型则多引起小儿散发病型。在我国虽将该病归属于法定丙类传染病，但一旦流行，传播快、波及面广，对人民健康及劳动生产力有很大影响，而且对年老体弱多病者及婴幼儿的威胁较大。为贯彻执行中华人民共和国传染病防治法及中华人民共和国传染病防治法实施办法队特制定本标准。本标准的附录A是标准的附录；本标准的附录B、附录C都是提示的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：中国预防医学科学院病毒学研究所。本
2、标准主要起草人2陶三菊。水标准由Jl生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。）丁）中华人民共和国国家标准流行性感冒诊断标准及处理原则GB 1 5 9 9 4 1 9 9 5 Diagnostic criteria and principles or management of influenza 1 范围本标准规定了流感的诊断标准及处理原则本标准适用于各级各类医疗、卫生、保健机构和人员对流感的诊断、报告和处理的应用。2诊断原则流感流行时般根据临床症状、结合流行病学可对病人作出初步诊断。如确定诊断则需要分离病毒阳性或病人双份血清抗体，测定恢复期抗体较急性期增高4倍或以上。3诊
3、断标准3. 1 流行病学史在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多$或医院门诊上呼吸道感染病人明显增多。3. 2 临床症状3. 2. 1 出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、全身酸痛、乏力等中毒症状。3.2.2 可伴有咽痛、干咳、流鼻涕、流泪等呼吸道症状。3.2.3 少数病例有食欲减退，伴有腹痛、腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。3. 3 实验室诊断3. 3. 1 血液化验检查白细胞总数不高或偏低。3. 3. 2 从病人鼻咽分泌物分离到流感病毒（见附录A）。3. 3. 3恢复期病人血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期有4倍或4倍以上升高（见附录
4、B）。3. 3.4 直接检查呼吸道上皮细胞的流感病毒抗原阳性（见附录C中Cl）。3. 3. 5 标本经敏感细胞增殖1代后查抗原阳性（见附录C中CZ）。3.4 病例分类3.4. 1 疑似病J具备3.1加3.2或3.1加3.2加3.3. 10 3.4.2 确诊病例疑似病例加3.3. 2或3.3.3或3.3.4或3.3. 5 0 4 处理原则4. 1 早期隔离病人、对症治疗病人和防治合并症早期发现病人、早期隔离病人是最重要的措施。对病人治疗一般采用对症治疗。防治并发症主要应防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎，特别是对年老体弱者或伴有心血管、慢性呼吸道疾病者或婴幼儿，国家技术监督局1995-12-15批准
5、1996-07 01实施:lfiO GB 1 5 9 9 4 1 9 9 5 流感本身或其合并症可能引起死亡，应特别注意加强治疗护理。4.2 顶防措施般采用综合性预防措施，讲究卫生，注意体格锻炼和营养，保持室内空气流通；对易感人群服采取相对隔离措施，如避免接触病人不去公共场所等；X才年老体弱者必要时可采用灭活疫苗接种或服用金刚烧胶等预防方法（但须注意金刚惋胶仅对防治甲型流感有效）。(;j A1 病毒分离GB 15994-1995 附录A（标准的附录）病原学诊断方法从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体。A2 标本的收集和处理A2. 1 标本收集时间应于发病早期（13d内）越早越好。A2. 2
6、标本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集儿童标本，采集时将灭菌棉拭子稍沽标本收集液（pH7.2 7. 6含20%40%灭菌肉汤的生理盐水或Hanks液或生理盐水），反复擦拭患者咽部数次，然后将此棉拭子放进装有上述收集液的试管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集成人标本，采集时先让患者咳嗽，然后用lOmL左右的收集液反复洗漱咽喉部约！min，吐入管内。如有条件，儿童标本用负压抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人标本用鼻咽洗液，可提高分离的阳性率。标本采集后1 i：冰壶（4c）中尽快送实验室。A2. 3 标本的处理：用毛细吸管反复吹打标本液（如为咽拭子标本，先反复挤压咽拭子后弃之），将粘液打
7、散，于4C静置5！Omin，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素1000单位和链霉素1OOO:;g, j昆匀匠4C处理24h即可接种。如标本污染较量，可置c过夜处理。如预计标本在48h内不能完成接种时，应将标本进低温（最好一7ocl保存。A3 接种及培养法最常用鸡胚培养法和组织培养法，有条件的亦可同时用两种方法进行病毒分离。A3. 1 鸡胚培养法取911日龄鸡胚，将处理过的标本液经羊膜腔和尿囊腔各接种0.2mL，每份标本接种34只胚，!I:33 35 c温箱培养到，然后将鸡胚放景4冰箱过夜（或置20冰箱lh再宣4数小时）即可分别收获尿液和羊水，并作初步血凝（其方法是用毛细吸管取l2滴尿液
8、或羊水，肯，大孔塑料板内，再加入12滴1%鸡红细胞，摇匀后置室温或43045min观察结果，根据血球凝集程度的不同可分为、士、一），如血凝为时，再按系列倍比稀释自由l定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鉴定。如血凝阴性，可盲传2代，如仍为阴性则弃之。A3. 2 组织培养法：用0.2mL处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾（或猴肾或地鼠肾），或狗肾传代细胞（MadinDarby Canine Kidney , MOCK），每份标本接种4管，置37c吸附12h后弃标本液，再加入每毫升含2g膜酶的199维持液lmL，于33培养7lOd，并逐日观察病变。从第三天开始每隔一天用0.4%鸡或豚鼠红细胞
9、对培养管做红细胞吸附试验（试验前无菌法收获细胞培养上清液），如阴性则用已收获的上清液盲目传代，如阳性则测定上清液的血凝滴度。如标本第1代红细胞吸附试验阴性，可用收获的全部上清液混合进行盲传2代，仍为阴性则弃之。A4 新分离株的鉴定新分离流感病毒可用血凝抑制l、补体结合、中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行鉴定。最常用和最简单的方法是血凝抑制试验，必要时采用补体结合试验。A4. 1 血凝抑制试验：用当前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清与新分离流感病毒做血凝抑制试验，观察新分离株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制试验方法见附录B.A4. 2 红细胞吸附抑制试验g取红细胞吸附试验阳性的组织
10、培养管和正常细胞对照管用Hanks液洗细胞2次，加入经霍乱滤液（ROE）处理（1 10）的免疫血清o.2mL，再加入HanksO.6ml，室温作用:l62 GB 15 994一199530niin 后，再加入0.4%鸡（或豚鼠红细胞0.ZmL，需室温30min后于普通光学显微镜下观察有无血球吸附。如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近。A4. 3 补体结合试验如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清对新分离病毒的血凝均不能抑制，1)11应考虑可能为甲型流感病毒的新亚型，可用针对甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作补体结合试验定型。B
11、1 血凝抑制j试验方法B1. 1 原理附录B（提示的附录）血清学诊断方法一些动物红细胞（如鸡、豚鼠等）以及人“。”型血红细胞上有流感病毒受体，遇流感病毒可产生红细胞在f集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒（血凝素）预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为Jlll I疑抑制j抗体效价。B1. 2 主要材料大孔塑料板，lmJ吸管或！ml，移液器。B1. 3 双份血清收集及处理急性期血清于发病3d内采取，恢复期血清于发病后24周采取。取O.lml已分离的血清加入。.9 (Ji; 0. 1 )ml，给：乱滤液（
12、RDEJ(Dl 10或15稀释摇匀，于37c水浴中过夜，以去除血清中的非特异性抑制索，次日贸56c水浴50min以灭活多余的ROE。81. 4 流感病毒血凝素制备1m:感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液，加入1/10000硫柳采防腐。为了延迟尿盐沉淀可先用无菌圭理盐水做等量稀释，民4C备用。B1. 5 1电红细胞悬液的制备从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏（Alsevers）液中，置4保存。用前以生理盐水洗3次，末次经2OOOr/min离心lOmin，将红细胞用生理盐水配成1%浓度。B1. 6 血凝素i商定将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1 5开始做系列倍比稀释，每孔0.25m
13、L再加入等盐1%鸡红细胞摇匀，置室温或4c3045min后观察结果，以出现血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为l个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为l 320.为1个单位，4个单位即为l 80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。B1. 7 血凝抑制试验步骤B1. 7. 1 将l：述己处理的待检血清（1 10或1 5）再用生理盐水做系列倍比稀舞，每孔加o.25mL。Bl. 7. 2 加入等量已配好的4个单位血凝素。B1.7.3 每fl加入。.25mLl %鸡红细胞，摇匀置室温或4C30 45min. B1. 8结果观察观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性孔内红细
14、胞自由下滑呈泪滴状时读结果。以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价。在检测患者双份血清时需在同一次试验中进行，并以恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上为阳性。,; B2型特异性补体结合试验B2. 1 原理GB 15994-1995 甲、乙、丙三个型流感病毒各具有特异的可溶性抗原（核蛋白抗原），甲型流感病毒各亚型均具有相同的可溶性抗原，与乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用补体结合试验来区别它们。当流感病毒出现很大的变异或出现新亚型而引起大流行时，由于来不及充分掌握新分离毒株的性状，常需同时采用补体结合试验和血凝抑制试验对新毒株进行血清学诊断。B2. 2 型特异免
15、疫血清制备B2. 2. 1 免疫用抗原甲型为PRS株和乙型为Lee株均为小鼠适应株。于乙酷麻醉下鼻腔感染1216g小鼠，每鼠O. 05ml，待感染后35d大部分小鼠发病、部分死亡时，解剖小鼠。取肺研磨并用生理盐水制成10%的悬液，低迷离心去除粗块，取上清鼠肺悬液即为免疫用抗原。B2. 2. 2 免疫血清制备选体重300500g的健康豚鼠，免前采血35mL，分离血清分装冻存留作对照。豚鼠用乙酷轻度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺悬液抗原0.5mL，共免疫34次，每次间隔一周，在末次免疫的同时，由腹腔注射鼠肺悬液2mL，一周后试血，如果对同型尿膜抗原的血清效价超过I 80，而与异型抗原无交叉反域，立即采血分
16、离血清分装冻存于低温（20C以下）。试验前血清于56水浴灭活30minoB2. 3 可溶性抗原的制备用甲、乙型流感病毒或新分离病毒按常规接种和收获尿囊液，如尿液血凝在I 40以上时，收获其尿提膜，将尿囊膜用盐水洗一次，用无茵剪刀将膜剪成数小块放入试管中，每个鸡胚的尿囊膜加1时，元菌生理盐水，冻化兰次，末次化后以3OOOr/min离心！5min，吸出上清即为可溶性抗原，加入1 0000 的硫柳录防腐，置4冰箱至少可用一个月。B2. 4 双份血清采集收集病人急性期（发病3d内）和恢复期（发病1030d后）的血清。血清于试验前5630min灭活。B2. 5 I%绵羊红细胞悬液制备、溶血素、补体的制备
17、和滴定按常规方法。B2. 6 补体结合试验步骤按常规进行。B2. 7 结果判定B2. . 1 被检病毒尿膜抗原与甲型或乙型）流感病毒免疫血清呈阳性反应则可诊断为甲型或乙型）流感病毒如甲、乙均为阴性时，应考虑丙型流感病毒或其他病毒。B2. . 2 双份血清对甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可诊断为甲型（或乙型）流感病毒感染。B2. . 3 正常人群补体结合抗体滴度一般在I 16以下，如单份恢复期血清抗体在1 32以上时，结合临床症状可作诊断的参考。B2. . 4 人群血清抗体水平调查中，补体结合抗体在I 32以上者可作为新近感染流感的证据。的神经氨酸酶抑制试验B3. 1 原理胎球蛋白（
18、Fetuin）底物经流感病毒的神经氨酸酶作用后，使N乙酸神经氨酸游离出来，经过碗酸盐的氧化作用将N乙酸神经氨酸转化为13-甲隆丙嗣酸后者经硫代巴比妥酸作用形成生色团，用有机溶剂提取生色团，并在分光光度计上比色。利用上述反应可测知流感病毒的神经氨酸酶活性，反应的颜色越深酶活性越强。并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。神经氨酸酶抑制试验是将标化好剂址的神经氨酸酶（即一定稀释度的流感病毒尿囊液）和系列稀释的被检血清和正常血清一起孵育，拥lj知:io4 GB 1 5 9 9 4 - 1 9 9 5 血itt作用于神经氨酸酶活性的抑制效价，并计算出血清的神经氨酸酶抑制滴度。B3. 2 器材及试剂的
19、2.1 小试管、JOmL吸管及分光光度汁等。83. 2. 2 磷酸缓冲液（PBSpH5. 9）及生理盐水。83. 2. 3 胎球蛋白底物液，450500mg冰冻干燥的胎球蛋白加蒸馆水lOml，溶解后置c保存，每周新自己。83. 2.4 过硝酸纳溶液：称4.Sg过串起酸纳（Na!O,l溶于38mL蒸馆水中，加62mL正磷酸（浓），充分混合，.，.，.于棕色磨口瓶中，室温保存。83. 2. 5 呻试剂2称lOg硝酸销（laAs（），）和7.lg无水硫酸纳溶于lOOmL蒸馆水中，加0.3mL浓硫酸，li-f三带玻璃塞的瓶中，il4 （保存。83. 2. 6 硫代巴比妥酸试ll 0.052 0.060
20、 0.074 0.288 0.422 0 592 正常血清十1单位病毒0.862 0 864 0.902 0. 676 0.622 0 604 0.612 神经氨酸酶活性%5 6 7 II 45 70 97 I）光密度。然后将对数稀释度换算为几何稀释度z例如10换算为1/1000,1035换算为1/3200.最后代入公式：. 70 45 (3200-1000） +1000=22005+1000=1440 50 45 此抗血清的神经氨酸酶抑制效价为1 1440 0 附录C（提示的附录）流感快速诊断方法C1 直接检查呼吸道脱落上皮细胞内抗原C1. 1 原理由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮细
21、胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。检查方法可采用免疫荧光法，一般于34h内即可完成，而且可以直接定型。c1. 2 标本的收集和制片儿童标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物，成人标本最好采用鼻咽洗液。可将每份标本分为两份，一份低温冻存备作病毒分离，一份用pH7.2磷酸缓冲液（PBS），将粘液吹打散，1500r/min离心15min去除上清，细胞沉淀用PBS洗12次，末次离心后弃上滑，加入适量pH7.2 PBS使细胞重悬，滴加于带圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙嗣固定！Omin0c1. 3 间接免疫荧光法C1. 3. 1 用10%新鲜羊或牛
22、血清封闭标本片，置湿盒中于3730min0c1. 3. 2 分别加入适当稀释度的抗甲型和乙型流感型特异性单克隆抗体，置湿盒中于37放置lh。在PBS中洗两次，共！Omin.366 GB 15994-1995 C1. 3. 3 加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物贵37lh。在PBS中洗三次，共lOmin，末次用蒸馆水过Cl. 3. 4 于荧光显微镜下观察结果，观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性细胞即可判为阳性。C2 标本经敏感细胞增殖1代后查抗原c2. 1 原理病人呼吸道标本经接种敏感细胞（狗肾传代细胞MOCK）增殖l3d后，将细胞消化分散制成抗原片再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内抗原。由于
23、标本中的病毒在敏感细胞增殖后查抗原，能明段提高其诊断的敏感性，吁在细胞病变出现以前查到抗！反可以直接定型，而且比常规鸡胚分离病毒法要快得多，4般2472h即可诊断。检查方法可采用间接免疫酶染法（C2.5）或间接免疫荧光法（C2.4) c2. 2 标本的收集及处理儿童标本可采用咽拭子，最好采用负压抽吸法g成人标本可采用咽漱液，最好采用鼻咽洗液。标本按附录A标准的附录）中AZ.3方法处理。C2. 3 标本的接种培养及制片取处理过的标本液0.2mL接种于长成单层的MOCK细胞，每份标本接种3管，置37c吸附l2h后奔去标本液，加入每毫升含2g膜酶的199维持液至lml，于35c培养24、48和72h
24、分别取出1管，收集上清备用，将细胞用消化液（1份0.25%膜酶4份Versene）消化下来，用PBS洗次，然后滴加于带回的玻璃片立，自然子燥，冷丙嗣固定。同法制备未经感染的正常MOCK细胞片即为正常对照细胞。口，4间接免疫荧光法c2. 4. 1 加单克隆抗体同Cl.3. 2, C2. 4. 2 力n兔抗鼠荧光素结合物同Cl.3.3,口，4.3 于荧光显微镜下观察结果，观察到胞浆内或胞核内荧光而正常细胞片未见荧光，即可判定为阳性。c2. 5 iHJ接免疫酶染法C2. 5. 1 主fl单克隆抗体同Cl.3. 2。C2. 5. 2 加适当稀释度的羊抗鼠酶标结合物，湿盒中置37Clh，用PBS洗两次I
25、Omin, c2. s. 3 加l邻苯二胶底物液，其配制方法为，4mg邻苯二胶!OmLpH5. 0磷酸拧楼酸缓冲液！5L双氧水。pH5.O磷酸缓冲液的配制方法为z先分别配制Ll0. !mol/L拧橡酸（C,H,C), H,() (2lg/1000mL l 和0.lmol/L磷酸氢二纳（Na2HP04)( 28. 4g/IOOOmL l，分别按24.3ml，和25.7mL混合后，再加入等重(5llmL）汉蒸水混合即为pH5.o磷酸盐拧橡酸缓冲液。加入底物液35min即可观察结果。C2. 5. 4 7二倒置显微镜下观察结果（观察结果时，细胞要湿，如果细胞己干，可以加入一滴自来水），观察到棕红色深染细胞，根据观察到的深染细胞多少记录为十十十、十、士、。以观察到十以上深染细胞判为阳性；有时可观察到单个深染细胞被无色或淡红色细胞所包围，而正常细胞对照呈无色或淡红色，亦可判为阳性。:6 7
