1、ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 19200-2003 猪水泡病诊断技术Diagnostic techniques for swine vesicular disease 2003-06-17发布中华国家人民共和国监督检验检瘦总局2003-12-01实施发布2R3 GB/T 19200-2003 前猪水泡病(SwineVesicular Disease，简称SVDl是猪的一种烈性传染病，被世界动物E生组织World Organization for Animal Health(英),Office International des Epizooties(法l，O
2、IE列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病主要在猪的蹄踵、蹄冠、唇、舌、鼻及乳头部引起水泡，临床症状与猪口蹄疫(Footand Mouth Disease，简称FMDl相似。本标准提出的实验室方法主要是以世界动物卫生组织(OIEl哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册为依据，并结合我国实际情况制定，其中猪水泡病反向间接血凝试验是我国建立的方法。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E均为规范性附录。附录F为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位g中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:张永光、牟克
3、斌、王永录、刘西兰、方玉珍。284 GB/T 19200-2003 猪水泡病诊断技术1 范围本标准规定了猪水泡病病毒分离及鉴定，反向间接血凝试验(RIHA)、琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)和病毒中和试验(VN)的技术要求。本标准适用于猪水泡病的诊断.反向间接血凝试验和琼脂凝胶免疫扩散试验适用于大批样品筛选试验，包括产地检疫、疫情监测、流行病学调查和无本病健康猪群的建立，病毒中和试验(VN)适用于诊断和迸出口猪检疫及抗体水平的评估。2 病毒分离及鉴定2. 1 材料准备2. 1. 1 灭菌注射器，研钵。2. 1. 2 pH 7. 6、0.05mol/L的磷酸缓冲液(PB)，pH7.6、50%的丙
4、三陈磷酸缓冲液(GPB)，pH7. 2、O. 11 mol/L的磷酸缓冲液(PBl，配制方法见附录A。2. 1. 3 仔猪肾传代细胞(IB-R5-2)，乳鼠。2. 1. 4 细胞培养液，见附录B。2.2 样晶的采集及处理2. 2. 1 水泡液z将水泡表面用75%酒精棉球消毒，用注射器抽取水泡液，直接放入灭菌小瓶中，加盖封口，避光送至实验室，不做处理直接用于检测。2.2.2 水泡皮s采集鼻镜、蹄部新鲜水泡皮，采集量为0.5g以上，放入预先加有pH7.6，50%的GPB的灭菌瓶中，加盖封口，送至实验室。2.3 细胞分离2. 3. 1 新鲜水泡液不做任何处理，可直接使用.当IB-R5-2长满单层细胞
5、后，弃去培养液，加入水泡液，以能淹没细胞单层为宜，于37C感作30min，然后补加4倍于水泡液的细胞培养液，置37C培养。每天在倒置显微镜下观察2次，48h终判，若细胞培养液对照孔成立，分离病毒的细胞孔细胞出现变圆乃至脱落，则视为细胞病变化PE)判为阳性，若48h不出现CPE，则应冻融2次，再育传3代，不出现CPE，判为阴性，出现CPE，则需做进一步鉴定。2.3.2 水泡皮的分离，将水泡皮用pH7.2、O.11 mol/L PB洗2次-3次，用灭菌滤纸吸去水分，称其质量后置于加少量石英砂或玻璃砂的研钵中，按质量体积比(1:2)-(1:5)加人pH7.2、0.11mol/L PB研磨，制成悬液，
6、室温浸毒1h或4C12h，以3000 r/min离心20min.30 min，取上清液用于病毒分离。2.4 现鼠分离2. 4. 1 乳鼠为2-3日龄小鼠，每份材料接种4只小鼠，每只颈背部皮下接种O.1 mL-O. 2 mL，在母鼠哺乳下观察5天。2.4.2 若5天内出现神经症状乃至死亡，剥皮去头及内脏，将肌肉及骨胳一起称量，按质量体积比加9倍的细胞培养液，加玻璃砂研磨制成悬液，置4C浸毒过夜，以1000 r/min离心10min，取上清液用于进一步鉴定。2.5 反向间接血凝试碰(RIHA)鉴定分离物285 GB/T 19200-2003 2. 5. 1 材料准备2. 5. 1. 1 96孔V型
7、聚乙烯血凝滴定板(110度)，微量振荡器或微型混合器，0.025mL、0.05mL稀释用滴管、乳胶吸头或25L、50L移液加样器。2.5. 1. 2 稀释液I、稀释液11，配制方法见附录C。2. 5. 1. 3 标准抗原、标准阳性血i宵。2.5. 1. 4 敏化红细胞诊断液，效价滴定见附录D，2.5.2 操作方法2. 5. 2. 1 使用标准抗原进行猪水泡病与口蹄疫A、0、C、Asia-1型鉴别诊断。2.5.2.1.1 被检样品的稀释z把8支试管排列于试管架上，自第1管开始，每管加。.5mL稀释液1, 第一管加0.5mL被检样品，由左至右做工倍连续稀释(即1 6、1 12、1 241768)，
8、每管容积0.5 mLo 2.5.2. 1. 2 按下述滴加被检样品和对照:a) 在血凝滴定板上的第一排至第五排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05mL，每排的第7孔i商加第7管稀释被检样品。.05mL.以此类推至第l孔;b) 每排的第9孔滴加稀释液10.05 mL.作为稀释液对照;c) 第一至第五排的第10孔按顺序分别滴加猪水泡病和口蹄疫A、0、C、Asia-1型标准抗原( : 30稀释)各0.05mL，作为阳性对照。2. 5. 2. 1. 3 滴加敏化红细胞诊断液先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第一排至第五排的第110孔分别滴加猪水泡病和口蹄疫A、0、C、AsiaI型敏化红细胞诊断
9、液，每孔0.025mL，置微量振荡器上振荡1min2 min，20C35C放置1.5h2h后判定结果。2.5.2.2 使用标准阳1生血清进行猪水泡病与口蹄疫0型鉴别诊断.2.5.2.2.1 在血凝滴定板上的第一排至第四排，每孔先各加入25L稀释液II.2.5.2.2.2 每排第1孔各加被检样品25L，然后分别由左至右做二倍连续稀释至第7孔(竖板)或第.11于LC横板儿每排最后孔留作稀释液对照。2. 5. 2. 2. 3 漓加标准阳性血清s在第一排、第二排每孔加入25L稀释液II.第二排每孔加入25L稀释至1: 100的猪水泡病标准阳性血清P第四排每孔加入25L稀释至1: 20的口蹄疫0型标准阳
10、性血清;置微型混合器上振荡1min2 min.:b盖置37C作用30mino 2.5.2.2.4 滴加敏化主工细胞诊断液:在第一排和第二排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25L;第二和第四排每孔加入口蹄疫0型敏化红细胞诊断液25L;置微型混合器上振荡1min,._, 2 min，加盖于20C35C放置2h后判定结果。2.5.3 结果判定2.5.3.1 按以下标准判定红细胞凝集程度:+什+为100%完全凝集，红细胞均匀地分布于孔底周围g十扑为75%凝集，红细胞均匀地分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点;斗十为50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点;+为
11、25%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞己沉积于孔底;一为不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。2.5.3.2 操作方法2.5.2.1的结果判定稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集时试验方成立。2. 5. 3. 3 若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病s若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型;以此类推。2.5.3.4 致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。286 GB/T 19200-2003 2.5.3.5 如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数(以2为底)浓度以上者即可判为阳性，其余
12、判为阴性。2.5.3.6 操作方法2.5. 2. 2的结果判定.稀释液H对照孔不凝集试验方可成立。2.5.3.6.1 若第一排出现2孔以上的凝集(什以上)，且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第三排、第四排不出现凝集，判为猪水泡病阳性。着第三排出现2孔以仁的凝集(才十以上)，且第四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第一排、第二排不出现凝集则判为口蹄疫0型阳性。如水泡病与口蹄疫均出现阳性反应，则判为同时感染水泡病与口蹄疫。2.5.3.6.2 致红细胞50%凝集的被检祥品最高稀释度为其凝集效价。3 琼脂报胶免擅扩散试验(AGID)3. 1 材料准备3. 1. 1 平皿(直径6.0 cm)、
13、打孔器、微量注射器或加样移液器、印相暗盒或台灯。3. 1. 2 琼扩精制抗原、标准阳性血清。3. 1. 3 琼脂糖凝胶缓冲液(AG酌，饱和硫酸馁，pH7. 2、O.01 mol!L的磷酸盐缓冲液(pH7.2、0.01 mol!L的PBS)，配制方法见附录E.3. 1. 4 琼脂糖。3. 2 操作方法3. 2. 1 琼脂糖平板制备取琼脂糖1.0 g加入99mL AGB, 103 kPa 10 min融化灭菌。吸取8mL琼脂液加到直径6cm的平皿内，制成3mm厚的琼脂板.待琼脂冷却凝固后加盖置于湿盒中，放4C冰箱备用。3.2.2 打孔孔径、孔距均为3mm，按图1所示式样打孔。用针头将孔内的凝块挑出
14、，并用烧热的大头针沿孔底部周围划圈封底。000 0。固1打孔式样3.2.3 被检血清样晶的处理3. 2. 3. 1 检疫用样品的处理56C水浴灭活30min。3.2.3.2 与口蹄疫鉴别及其分型诊断用样品的处理z吸取56C水浴灭活30min的被检血清0.4mL. 加pH7.2、0.01mol!L的PBSO. 4 mL，混匀，逐滴加入饱和硫酸镀溶液0.2mL，摇匀，室温静置20min, 8 000 r/min离心15mn;取上清液逐滴加入饱和硫酸馁。2mL，摇匀，室温静置20min, 8 000 r/ mm离心15min，沉淀物用。.2 mLO. 4 mL pH7. 2、0.01mol/L的PB
15、S重新悬浮。此悬浮液供正式试验用。3.2.4 加样每4份被检样品取5块平皿，按图2所示方式加样。287 GB/T 19200一2003。( 0 ( 0 。 SVD FMDA 。 FMD 0 FMDC 。80 Asia- 1 固2加样方式glJ中央孔分别加SVD、FMDA、0、C、Asia-1型精制抗原30L，每个平皿的1、4孔相应地加入SVD、FMOA、0、C、Asia-1型阳性血清(用PBS做1 10稀释)30L，作为阳性对照;每个平皿的2、3、5、6孔分别扭1入被检1、2、3、4号血清样品30L。室温放置2h3 h，待样品扩散入琼脂层后，置于潮湿小室中37C下扩散。3.2.5 观察扩散24
16、h后开始观察。观察时可借助灯光或自然光源，也可用暗背景或用产生暗视野的观察箱，一般观察5d7 d后做最终判定。3. 3 结果判定3. 3. 1 每个平阻的1、4孔与中央孔之间均出现沉淀线试验方可成立。3.3.2 每个平皿的2、3、5、6四个样品孔与中央孔之间若出现沉淀线，则判为阳性，并与中央孔所加的抗原同病(型);若未出现沉淀线，Ijj判为阴性。4 病毒中和试验(VN)4. 1 材料准备4. 1. 1 50L移液加样器，微量细胞培养板，100mL细胞培养瓶.温箱，二氧化碳培养箱，倒置显微镜。4. 1. 2 细胞z仔猪肾传代细胞ClB-RS-2)。4. 1. 3 细胞培养液(细胞生长液、细胞维持
17、液)，配制方法见附录B，4. 1. 4 标准病毒、标准阴性血清、标准阳性血清。4.2 操作方法本试验是50L量的等体积试验。4. 2. 1 被检血清和阴性、阳性血清处理56C水浴灭活30mio o 4.2.2 稀释病毒:用细胞维持液(见附录即将己测病毒滴度的病毒液稀释至含100TCIOco。并按式(1)计算病毒稀释倍数(X)。x (A-B)的反对数( 1 ) 288 GB/T 19200-2003 式中:X一-稀释倍数:A一二已测得50L病毒稀释液中所含病毒TCID，o数量的常用对数，B 中和试验要求每孔病毒量(OOTCID川的常用对数，本试验为204.2.3 稀释血清s从1 4稀释开始，将血
18、清在极上横向做二倍连续稀释，每份血清做两排孔。4.2.3.1 被检血清的稀释:用细胞维持液从1 4开始做二倍连续稀释，一般至1 64，若进行中和抗体效价评估可进一步做二倍连续稀释。4.2.3.2 阴性血清的稀释2用细胞维持液做1 4、1 8稀释e4.2.3.3 阳性血清的稀释=用细胞维持液将已知效价的阳性血清从1 4开始做二倍连续稀释，直至血清效价后两个稀释度。若血清效价为1 256，稀释至1 1 0240 4.2.4 病毒血清中和g向被检血清和阴性、阳性血清各稀释度的微量板孔中，逐孔加入等量(50L)的稀释病毒液(每50L悬液中病毒含量为100TCID川，加盖后于37C孵育1ho 4.2.5
19、 接种细胞向每个血清-病毒混合物及对照孔中加入50L浓度为每毫升10个细胞的IBRS2细胞悬液。细胞对照孔加维持液100L，阴性、阳性血清对照孔各加血清50L和维持液50L，病毒滴度复测对照孔加各稀释度病毒100Lo4.2.6 培养与观察z微量板加盖，用透明胶带密封，于37C混箱中孵育48h-72 h，也可选用合适的盖子将板盖紧，置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37C孵育48h-72 ho每天用倒置显微镜观察致细胞病变化P酌，并记录结果。猪水泡病病毒。VDV)的CPE，在光学显微镜下SVDV致病变的细胞变圆，固缩而成颗粒状，聚集成堆或散在，大小均匀，折光率强，细胞质内有空泡，部分细胞脱落或崩解
20、成碎片.在观察时应注意区分病变与衰老或理化等因素造成的细胞变性死亡。4.3 结果判定3TC孵育72h后，可将板最后固定并进行常规染色。用10%福尔马林盐水固定30min，再将微量板浸入用10%甲应配制的0.05%亚甲蓝中染30mnt并将板在水龙头下冲洗干净，做晕终判定.4. 3. 1 判定条件细胞层蓝染是阳性，不着色为阴性。正常细胞对照z生长良好，无CPE，细胞层蓝染.阴性血清对照z效价1: 4及以下，细胞层不着色。阳性血清对照z再现原血清效价或允许误差在原效价的2倍以内(2士，)臼原血清效价为l256，允许误差范围为(: 125)-( , 512)。病毒滴度复测对照再现原病毒滴度或允许误差在
21、原滴度的土O.5以内(士0.519 TCID川。如病毒原滴度为10-70，病毒复测滴度应在10-_0-7.，之间，当上述对照正常时，该中和试验成立并按下列方法和标准判定。4.3.2 判定4. 3. 2. 1 两孔的细胞都病变，细胞层不着色，判定为中和抗体阴性。4.3.2.2 两孔的细胞都不病变，细胞层蓝染，判定为中和抗体阳性。4.3.2.3 其中一孔细胞病变、不着色，另一孔细胞不病变、蓝染，判定为可疑。4.3.2.4 中和抗体效价评估:病毒-血清混合物能使细胞孔50%不发生CPE的血清最高稀释度，即为该血清的中和抗体效价。4.3.3 判定标准根据OIE哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫
22、苗标准手册)(2000版)推荐的水泡病诊断方法，被检血清中和滴度达1: 45或更高判为阳性，按凯波尔(Krber)氏计算方法计算血清中和滴度，计算方法参见附录F，I:16-1 : 32判为可疑，1: 11及以下班j为阴性。如果必要，可疑及个别阳性样品应重检。289 GB/T 19200-2003 附录A(规范性附录)缓冲液配制方法A. 1 pH7. 6、0.05mol/L的磷酸缓冲液(PB)的配制甲液磷酸氢二纳(Na，HPO, . 12H2 () 加蒸馆水至1000mL 乙液磷酸二氢饷(NaH2PO, . 2H2 ) 加蒸恼水至1000 mLo 取甲液870mL.乙液130mL混合，即为pH7
23、.6、0.05mol/L的PB。A.2 pH7.6、50%的丙三醇磷酸缓冲液(GPB)的配制17.9 g 7.8 g l容积的丙三醇(分析纯或化学纯)与等量的pH7.6、0.05mol/L PB混合，103kPa高压10min灭菌即成。A.3 pH7.2 ,0.11 mol/L硫酸缓冲液(PB)的配制甲液z磷酸氢二纳(Na2HPO，.12H20) 加蒸馆水至1000 mLo 乙液磷酸二氢纳(NaH2PO，. 2H20) 加蒸馆水至1000 mL。取甲液720mL、乙液280mL混合，即为pH7.2、0.11mol/L的PBo细胞生长液的配制g核牛血清附录B(规范性附景)细胞培养液配制方法Eag
24、le-MEM(Eagle是最低限度必要成分培养液)0.5%LfI(水解乳蛋白，LactalbuminHydrolysate)-Hanks(或Earles)青、链霉素7.5%碳酸氢销细胞维持液的配制不含核牛血清的细胞生长液。290 39.4 g 17.2 g 10% 45% 45% 各lIU/mL、1g/mL调pH至7.2巳1稀释液I的配制聚乙二醇12000兔血清(62C水浴灭活30min) 叠氮纳(NaN) 附录C(规范性附录)稀释液配制方法加pH7.2、O.11 mo1汀，的PB至1000 mL，置4.C8.C存贮。C. 2 稀释液E的配制O. 1 mol/L磷酸二氢销(NaH，PO， 2H
25、2) O. 1 mol/L磷酸氢二销(Na2HPO, 12H,() 氯化纳(NaCl)聚乙烯毗咯烧嗣CPVP)吐温80(Tween-80)叠氮销CNaN3) 用蒸馆水稀释至1000 mL，加楼牛血清5mL，置4.C8C存贮。附录D(规范性附录)敏化红细胞诊断液活力滴定方法GB/T 19200-2003 O. 5日10.0 mL 1. 0g 115.0 mL 385.0 mL 8. 5 g 25.0 mg 0.05 mL 1. 0g 标准抗原做1: 10稀释(实际浓度为1: 30).然后在微量板孔内进行连续稀释，即1: 60、1: 120 .1 : 3840，并滴加敏化红细胞诊断液测定其活力。当
26、活力低于1 60时不能使用。附录E(规范性附录)缓冲液及饱和碗酸镀配制方法E. 1 琼脂糖凝胶缓冲液(AGB)的配制时氨酸巴比妥锅叠氮纳加蒸馆水至200mL，用。.2mol/L盐酸调pH至7.9。E.2 pH7. 2 , 0. 01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)的配制甲液磷酸氢二纳CNa，HPO, 12H,0l 加蒸馆水至1000 mLo 15.0 g 0.52 g 1. 0g 39.4 g 291 G/T 19200-2003 乙液z磷酸二氢铀CNaH，PO，. 2H2() 加蒸馆水至1000 mL. 取甲液720mL、乙液280mL混合，即为pH7.2、0.01mol/L的PBS。1
27、7.2 g E.3 饱和硫酸绥的配制将760g硫酸钱加入1000mL蒸馆水，加温完全溶解(温度不超过80C);室温放置冷却后，用浓氨水调pH至7.27.4.在室温下有少量硫酸镀析出，其上清液即为饱和硫酸镀。附录F资料性附录)凯玻尔CKrber)计算方法F. 1 固定病毒，稀释血清法Cp法)这种方法是将不同稀释度的血清与固定量病毒液(一般为100个TCID;o)混合，置适当的条件下感作一定时间以后，再将血清病毒混合物接种子敏感细胞中，测定被检血清阻止组织培养细胞发生病毒感染的能力及其效价。以能够保护50%组织培养细胞不发生病变、感染或死亡的血清最离稀糖倍数，作为该血清的50%中和效价(PD50)
28、。按式(F.1)计算。PD;o(以对数表示)= L+d(5-0. 5) . . . . ( F. 1 ) 式中:L二一最低稀释度(用对数表示); d-组距.NP稀释系数(用对数表示), S 各组死亡(或感染)或保护的比值C死亡(或感染)数/接种数的和(用对数表示)。举例说明如下(见表F.) 表F.lKrber法计算中和漓度示1JlJ血清稀释度保护比率血清稀释度保护比率1/4 -10 -(). D 4/4 1 1/256= 10-2, 。1401116=10- 1.2 3/40. 75 1/1 024=10 2.0 0/40 1/64=10-U 2/40. 5 注接种剂量为0.1mL。L=-0.
29、6 d= 0.6 5=2.25 PD50(以对数表示)= -0.6-0.6(2.25-0.5) = -. 65 即待检血i宵的50%中和效价=101.65=1/45.也就是1: 45稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于感染、死亡或出现CPE。F.2 固定血清-稀释病毒法(法)这种测定方法是在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清(对照组和待检血清l司时进行测定，计算每一组的TC1D5o然后计算中和指数(表F.2)。按式CF.2)计算3D-D C一CT-T 组一组验一照试一对一一数指和中C F. 2 ) 292 GB/T 19200-2003 表F.2固定血清稀释病毒
30、法计算中和指擞示例病毒稀释度10 - 10-2 10-1 10-1 10 -, 10- 6 10 TCID5u 对照血清组保护率4/4 3/4 1/4 。/410 待检血清组保护率4/4 2/4 1/4 。/4。/4。/4。/410-2-2 根据表F.2计算t试验组TCID5010- 2. 2 中和指数=一一一一一一-= :，丁=1995 对照组TCIDso10-5 说明待检血清中和病毒的能力为对照血清的1995倍。通常，待检血清的中和指数大于50者，即可判为阳性;1049为可疑川、于10为阴性。293 GB/T 19200-2003 参考文献世界动物11.生组织(OIEl农业部畜牧兽医局译.哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准于册.巾国农业科学技术出版社2002294
