1、GB/T 19438.3-2004 前-F司GB/T 19438-2004(禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法分为以下四个部分:一-GB/T19438. 1-2004(禽流感病毒通用荧光R丁PCR检测方法沁甲一-GB/T19438. 2-2004(H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法以GB/T 19438.3-2004( H7亚型禽流感病毒荧光RTPCR检测方法); GB/T 19438. 4-2004(H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法儿本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位z中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基
2、生物工程股份有限公司。本部分主要起草人高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。I 1 范围H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件GB/T 19438.3-2004 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 19438. 1-2004 禽流感病毒
3、通用荧光RT-PCR检测方法3 缩暗语下列缩略语适用于本部分。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链式反应。3.2 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。3. 3 RNA 核糖核酸。3.4 Taq酶Tq D0JA聚合酶。3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。3.6 DEPC 焦碳酸乙二醋。4 原理采用TaqMan方法，通过比对禽i流感病毒血凝素基因，设计对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探钊的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5端标记FAM荧光素为报告荧光基因(R)，3端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5端荧光基
4、团发出的荧光信号，称为洋灭荧光基因。反应在退火时，号|物和探针同时与目的基因片段结合，1 GB/T 19438.3-2004 探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时，T叫酶发挥53的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料5. 1 试剂除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)进行分装。5. 1. 1 H7亚型禽流感病毒荧光RT.PCR检测试剂盒
5、lV试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A。5. 1. 2 三氯甲烧。5. 1. 3 异丙醇。5. 1. 4 75%乙醇，用新开启的无水乙障和无RNA酶的水配制。5. 1. 5 0.01 mol/L (pH7. 2)的PBS:配方见GR/T19438. 12004中附录A，121 c士2c , 15 min 高压灭菌后，无菌条件下按10000 IU/mL加入青霉素和链霉素。5.2 仪器设备5. 2. 1 高速台式冷冻离心机=要求最大离心力在12000r/min以上。5.2.2 荧光PCR仪。5.2.3 计算机。5.2.4 2C 8 c冰箱。5. 2. 5 - 20 c冰箱。5.2.6 微量
6、加样器:O. 5L 10，1.:5L201.; 20 I. 2001.;200L 1 000L 5.2.7 i.昆匀器。5.2.8 可移动紫外灯:要求近工作台面。6 样品的采集与前处理采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6. 1 取样工具需要下列取样工具z棉拭子，剪刀、慑子，Eppendorf管，研钵。以仁取样工具必须经121c士2oC , 15 min高压灭菌并烘干。6.2 采样方法6. 2. 1 活禽样品2 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为2对于咽喉拭子，采取时要深入喉头及t项裂来回刮3次5次取咽喉分泌液;取泄殖腔拭子时，将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便，1
7、)由指定单位提供，给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GB/T 19438.3-2004 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中备用。6.2.2 肌肉或脏器样晶用无菌的剪刀、慑子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，加10mL PBS混匀，1000 g离心10min 后，取上清液转入Eppendorf管中备用。6.2.3 血清或血浆用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用。6.2.4 保存与运送采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h，长期保存须在70 c以下，
8、但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。7 操作方法7. 1 实验室的设置与管理实验室的设置与管理见GB/T19438. 1-2004中附录c，7.2 样本的制备7. 2. 1 在样本制备区进行。7.2.2 样本的制备程序37.2.2.1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及管阴性对照之和，对每个管编号标记。7.2.2.2 每管加入600L裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200L.一份样本换用一个吸头;再加入200fL三氯甲饶，海匀器上剧烈震荡混匀Sh于4c条
9、件下.12000 r/min离心15min。7.2.2.3 取与7.2.2.1中相同数量的1.5 mL灭菌Eppendorf管，加入500L异丙醇(-20 c预冷) 对每个管编号标记。7.2.2.4 吸取7.2.2.2离心后各管中的上清液转移至己加入异丙醇的相应管中，上清液至少吸取500L，不要吸出中间层，颠倒混匀。7.2.2.5 于4c条件下.12000 r/min离心15min ，注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置。轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品须在吸水纸不同地方沾干。7.2.2.6 加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。于4c条件下，12000r/mi
10、n离心15min 0轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，?占干液体。7.2.2.7 4000 r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3rnin。不宜过于干燥，以免RNA不溶。7.2.2.8 加入11fL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000 r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于一70c条件下。7.3 靶核酸的反转录和扩增7. 3. 1 扩增试剂准备与配制7.3. 1. 1 在反应混合物自己制区进行。7.3. 1. 2 从试剂盒中取出相应的
11、RT-PCR反应液、T叫酶，待反应液室温下融化后.2000 r/min离心5 s。设所需PCR反应数为n.其中n为待检样品数、一管阳性对照及管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15f L RT-PCR反应液及O.25L Taq酶。计算各试剂的使用量，加入试管中，向其中加入0.25X n颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15fL，转移至样本处理区。7.3.2 加样7.3.2.1 在样本处理区进行。3 GB/T 19438.3-2004 7.3.2.2 在各设定的PCR管中分别加入7.2.2.8制备的RNA溶液各10L.盖紧管盖后，500r/min 离心30s。7.3.3
12、 荧光RT-PCR反应7.3.3.1 在检测区进行。7.3.3.2 将7.3.2.2中加祥后的PCR管放入荧光PCR检测仪内并记录样本摆放烦序。7.3.4 反应参数设置荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的反应参数为:一第阶段，反转录42C /30 min; 一第二阶段，预变性92C/3 min; 一第三阶段.92C l1o s ,45 C/30 5.72 C /l min，5个循环s第四阶段，但C/105.60 C/30 s.10个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。8 结果判定8. 1 结果分析条件设定8. 1. 1 读取检测结果，阕值设定原则以|揭值线刚好超过正常阴性
13、对照扩增曲线的最高点。8. 1. 2 不同仪器时根据仪器噪音情况进行调整。8.2 质控标准即j性对照的检测结果应没有特异性扩增，阳性对照的Ct值应小于28.0.8.3 结果描述及lrj定8. 3. 1 阳性G值小于等于30伞。，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在H7亚型禽流感病毒。8.3.2 阴性无Ct值并且元扩增曲线，表明样品中无H7亚型禽流感病毒。8.4 有效原则Ct值大于30.0的样本须重做嘈重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。4 GB/T 19438.3-2004 附录A(资料性附录)H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR试1flJ盒组成、说明、功能及使用时的注意事项A. 1 试剂盒组
14、成每个试剂盒(规格为48反应/盒)包括以下成分2裂解液30 mLX J盒DEPC 7.K H7亚型禽流感病毒RT-PCR反应液RT-PCR酶T叫酶阴性对照阳性对照(非感染性体外转录RNA)A.2 说明1 mLX1管750LX1管1颗/管X12管12LXl管1 mLXl管1 mLXl管A. 2. 1 裂解液的主要成分为异硫氨酸肌和盼，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4c保存，其他试剂保存于20 c。A. 2. 2 DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA，A.2.3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。A.3 使用时的注意事项A. 3. 1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。A. 3. 2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。A.3.3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。俨J
