1、GB/T 19440-2004 前禽流感山正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起，其中高致病性禽流感因其传播快、危害大，世界动物E生组织(IE)将其列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术CNASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考。IE(诊断试验和疫苗标准手册以2000年版).并结合我罔现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和中华人
2、民共和国上海出人境检验检疫局提出。本标准由同家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。本标准起草人:单松华、刘乐庭、倪胃红、胡永强、李树清。I GB/T 19440-2004 禽流感病毒NASBA检测方法1 范围本标准规定了NASHA快速检测禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于禽类、禽肉产品中所有亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。2 规范性引用文件F列文件巾的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注H期的引用文件，其随后所有的修改币(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准.然
3、而.鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否叮使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 18936 2003 高致病t禽流感诊断技术3 原理!JASBACNucleic acid seque盯c-bascdamplification .ASBA，依赖核酸序列的扩增技术)是项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶)和两条寡核昔酸11物。七游引物5f末端含有噬菌体T7的依赖于DA的RiA聚合酶的启动子序列，下游引物的5末端含有和钉标电化学发光检测探针瓦补的序列。在扩增tt骤中，两个5F端都整合进扩
4、增序列中，这样既成为产生豆补RiA序列的模板，义能特异性结合检测步骤中的ECL探针。扩增底物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表l面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECU反应。己杂交的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的R1IA扩增产物总量成比例对应。4 材料准备4, 1 试验环境于净的环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。4, 2 器材采J1j常规的分子生物学器材，包括次性于套、移液器(量程5ILL到200L)、枪头、无RNA酶的, 5时，塑料离心管、1.5 mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精度+2C1、加热器、水浴
5、锅、5mL聚内烯试管(VWRl、封口膜。如果采用ECL方法，需要NucliSens阅读器或者其他等同仪器。如果采用阳，ISA方法，需要酶标仪。4, 3 引物t游引物AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAG G A(A/GlG GCA TT( C! Tl TGG ACAAA(G/Tl CGT CTA 下游引物GAT GCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TA 4, 4 检测试剂所有检测试剂在使用前，使其达到室温。a) 裂解缓冲液:5rnol/L异硫氨酸肌，10%TritonX-l00
6、, 10 mmol/LTis-HCl.pH 8, :3 , M 冲洗缓冲副主5mol/L异硫氨酸抓，10mmol/L Tri白HC1.pH8，3，GB/T 19440-2004 。500mg/mL硅土500mg/mL盐酸活化的工氧化硅;c!) 洗脱缓冲液:10 mmol/L Tis-HCI，pH 8, 3; e) 酶溶液(参y附录A); f) 崎捉探针;10mrnol/L牛物素化寡聚核背酸;价HIJ列为日iotinCC(; TCA G(;仁CCCCTC AAA GCC GA 自)电化学发此法属别检9W探针(10m:vIgeneric ECL detection probe); fJ标记的DNA
7、寡聚核背酸;ECL序列为(;AT GCA AG(; TCC CA T ATG AG CTT CT A ACC CAG GTC GAA ACG T A h) 仪器调试参照液;10 mrnol/L NASI:lA CP; 1 mmol/L Tris-HCI pH8, 3; 3 rnmol汀，ASBA-ECL; i 检测稀释液15rnmol!LTris-HCl, pH 8.3; j) 分析缓冲液，50mmol/LTris-HCl, pH 8.3 , 1 X PI:lS (l 37 rnmol!L NaCl, 2.7 rnmol/L KCl, 10 mmol/L Na, HPO 2 mrnnl/L K
8、H2PO,), k) 清洗液，100mmol/L KOH , 10%SDS , 10% Triton X-I00 , 1) 无水乙醇alcohol.4.5 样晶采集、保存、处理f女GI/T18936-200:，巾2.1进行。5 操作方法5. 1 核酸释放和提取按以下顺序a) 将0.1mL样品Jm入盛行。.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合;I仆振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加入00IL, c) 振荡混合均匀;d) 写气温干温育10rnin(每2min振荡混合一次，防止硅士沉淀), 时在12口00r/min下离心裂解缓冲液节:30问。小心移除上清液(不耍搅动沉淀)后，J每个管中加入1mL冲洗缓冲液
9、gg) 振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止;h) 在12000 r/ rnin -f离心:lOs，然后移除上清液;i ) 重复第f)步到第h)步的步骤。依次为一次使用冲洗缓冲液;两次使用70%乙醇;最后次使用100%乙醇;j) ill石一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙蹲;k) ) 史川加热器在560C敞IJ干燥硅土10rnin(用薄纸覆盖每个管避免污染h卜燥后向每个管加人50IL洗脱缓冲液;01) 振荡试管宦至沉淀物再次重新完全悬浮，n) 560C温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸。mln后斤始振荡试管); n) 在12000r!rnin F离心2min; p) 将5L核酸七清液转移至
10、新试管，在1h内开始扩增反应。以上步骤也叮采用Qiagen试剂盒或者真他等同试剂盒进行。5.2 核酸扩增按以下顺序a) wLr述5L核酸5.1p)J中力11入10L扩增试齐IJ(参见附录A); b) 600C温育5m111;2 c) 41C温育5mn;d) 加入5fL酶熔液(参见附录胁，并月1手指轻轻J口击试管促使混合均匀pe) 放回试管，并继续在11C温育5mln，f) 将试管稍作离心后，在41c温育90min; g) 检测扩增产物;h) 在70(:下保存扩增产物不超过30d, 5. 3 核酸检测按照以下步骤或用ELlSA进行检测:a) 将CN十2)个5mL聚丙烯试管进行编号。试管1作为空白
11、对照;b) 振荡混合，除了试管1外，其余试管各加入20L杂交熔液(参见附录。，c) 试管2中加入5IL检测稀释液作为全臼对照;d) 其余试管各加5LRNA扩增产物;e) 封口膜封住所有试管，振荡混合;f) 所有试管41吃温育30min口每10min 混合一次;g) 除f试管I外，其余试管各加入0.3mL分析缓冲液;h) 振荡仪器调试参照液直至不透明，然后加。.25mL IRS到试管1, i ) 把试管放在转盘式传送盘的适当位置上;j ) 6行NucliScns阅读器，对数据进行分析和解释(参见附录D)。6 结果判定GB/T 19440-2004 通过大量分析己知阴性对照样品后，确定NASI3A
12、/ECL的临界值为o.15 X仪器参照溶液的数值口样品的读数超过临界值时，判为禽流感病毒阳性，低于临界值肘，判为禽流感病毒阴性。1) N为样品数。1 GB/T 19440-2004 A. 1 配制材料附录A(规范性附录)扩增试剂的配制a) 球状骨针单个球状骨针为10mg , 4 mmol/L NTP , 15 mrnol/L DTT, 40 rnrnol/L MgC12; ),) 球状骨针稀释剂;100mrnol/L Tris-HCl pH8. 3 , 2 mrnol/L dNTP; c) 100 mrnol/L氯化御溶液，d) 10 mrnol/L引物混合物，e) DEPC丁水。A.2 配制
13、过程a) 单个球状骨针中加入80L球状骨针稀释剂，并迅速振荡均匀;),) 稀释的球状骨针中加l入16L氯化饵溶液和14LDEPC水，振荡均匀，c) 加入10IL引物混合物，振荡混合，d) 不能离心gc) 在;:;0min内使用。B. 1 配制材料附录B(规范性附录)酶溶液的配制a) 酶球:单个酶球(6.5mg)含1.3 U/L AMV.RT , O. 5 U/L RN ase H , 1. 3 U!L T7 RNA聚合酶，100mmol汀.Tris-HCl，pH8. 3 , 10%BSA; ),) 酶球稀释和J;0. ，12g/，L RSA。B.2 酶溶液的制备a) 单个酶球中加l入55I，L
14、陷稀释液，将此溶液放置室温至少20rnin; b) 用手指轻轻扣上七试管H酶球充分溶解，c) 不能剧烈振荡任何含酶的熔液;d) 使用前，稍作离心:e) 在60min内使用。巳1配制材料附录C(规范性附录)杂交溶液的配制a) 捕捉探针，10mmol!L生物素化寡聚核背酸;GB/T 19440-2004 b) 电化学发光法属别检测探针(lOmMgenericECL detection probe):钉标记的DNA寡聚核背酸。C.2 杂交溶液制备a) 振荡通用型捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。b) 对于N次特异性检测反应，在新试管中混合(N十2)X 10L捕捉探针和I(N+2)X 10L E
15、CL探针。c) 使用前稍作振荡。d) 在60min内使用。附录D(资料性附录)NucliSens阅读器的操作运行D. 1 建立一个新的运行程序。D. 1. 1 打开NuclSens阅读器的个人电脑。D. 1. 2 在开始界面点击Prlme来执行系统校准。D. 1. 3 机器准备好后，点击.Start。校准步骤大约持续3mino D. 1. 4 在登入Oog-in)界面的用户名(username)上选择Serviceengineer并且点击Login。不需要输入密码。D. 1. 5 在屏幕左上方选择Routine菜单然后点击N巳wrun。D. 1. 6 在弹出的工作表界面点击yes。D. 1.
16、7 输入文件名(不超过8个字符)并且点击ok。D. 1. 8 一个工作表单会打开，在分析选择栏(selectedassay)选择Fr气re臼et山ub快e飞。D目.1.9输入样品号并且点击Addto lis目tD. 1. 10 重复上述步骤直到输入所有样品ID。D. 1. 11 输入所有样品号后，点击Close旷键。D. 1. 12 屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表，检查无误后点击ok。D.2 确定样品放在转盘式传送盘(instrumentcarousel) _ r. ，并且按照计算机中输入的样品ID顺序摆放。D.3 在屏幕上方选择Routine菜单然后点击Runworklist。D.4 出现一个检查弹出窗口，点击Proceed。D.5 检测开始(每个试管用时大约1.5 min)。D.6 检测停止后，在屏幕左上方选择Routine菜单然后点击Sampleresults或者Assayresult，显示结果。口
