1、囝亘中华人民共和国国家标准GBT 23476-2009松材线虫病检疫技术规程Technical regulation on quarantine for the pine wilt disease2009-04-0 1发布 2009090 1实施丰瞀鳃紫瓣警矬瞥翼发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 昌GBT 23476-2009本标准的附录F为规范性附录，附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录G为资料性附录。本标准由国家林业局提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：国家林业局森林病虫害防治总站、江苏省森防站。本标准主要起草人：熊惠龙、李海燕、徐克勤、赵宇翔。
2、松材线虫病检疫技术规程1范围本标准规定了松材线虫病的检疫技术规程。本标准适用于松材线虫寄主植物及其加工制品等检疫工作。2规范性引用文件GBT 23476-2009下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 23478-2009松材线虫普查监测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31松材线虫病pine wilt disease caused by pine wood n
3、ematode由松材线虫寄生在松树体内引起松树迅速死亡的一种毁灭性林木病害。又称松树萎蔫病、松材线虫萎蔫病、松树枯萎病。32松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(Steiner et Buhrer)Nickle一种无脊椎动物，属于线虫门(Nematoda)，侧尾腺纲(Secernentea)，滑刃目(Aphelenchida)，滑刃总科(Aphelenchoidoidea)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。33检疫quarantine为了保护一个国家或一个地区人民的
4、身体健康和农林牧业的生产安全，根据国家和地方政府颁布的检疫法规，由法定的专门机构，对那些主要通过人为活动而远距离传播的流行性疫病所采取的检疫检验和严格的检疫处理措施。34疫木the diseased wood感染松材线虫病的寄主植物及其制品。主要为松属(Pinus)植物及其制品，包括松木包装材料、电缆盘等。35检疫检验quarantine inspection对检疫法规所规定应施检疫的森林植物及其产品，通过一定的技术手段检查、检验是否带有害生物。36媒介昆虫intermediary insect将松材线虫由罹病树中携带而出，通过补充营养或产卵时造成的创口又将其传染到其他寄主松树上的昆虫，是松材
5、线虫病发生不可缺少的条件，是松材线虫病侵染循环的组成部分之一。松材线虫病媒】GBT 23476-2009介昆虫必须具备以下三个条件：一是生活史与松材线虫的生活史相吻合；二是具有一定的种群密度三是能够携带一定数量的松材线虫。37松木及制品pine wood and woodenware松属原木、锯材和用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、木条箱、木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木、衬木等。经人工合成或经加热、加压等深度加工的包装木质材料，如胶合板、纤维板等除外。38松墨天牛Monochamus alternatus Hope属节肢动物门(Arthropoda)，昆虫纲
6、(Hexapoda)，鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，墨天牛属(Monochamus)，是松材线虫病的主要媒介昆虫。又名松褐天牛、松天牛。39木材蓝变wood blue-stain由于蓝变菌(或称青变菌)的存在而导致木材变为蓝灰色。它是松材线虫病木取样的一个辅助而非必要依据。310分散型3龄幼虫(L)dispersal thirdstage larvae夏末初秋，松材线虫病枯死木中出现与增殖期3龄幼虫不同的另一类型3龄幼虫，从形态上表现出内含物显著增加，它可以抵抗不良环境条件如冬季寒冷和木材失水，被称为分散型3龄幼虫。311持久型4龄幼虫(L)dauer l
7、arvae由分散型3龄幼虫蜕变而来，除虫体角质膜较厚外，它没有口针，食道退化，头圆丘形，尾端明显指状，体表覆盖保护性的胶粘物。易于附着在媒介昆虫的体上，以利于媒介昆虫的携带和传播。312批batch应检验对象的抽样单位。“批”是指同一地点、同一日期、同一品名和同一运输工具运载的应检验物品。313抽样sampling为确定应检验对象是否感染松材线虫，根据检疫技术规程要求而抽取一定数量样本的过程。4应施检疫的植物及其产品来自国内外疫情发生区的松属、雪松属、冷杉属、云杉属和落叶松属等植物的苗木、接穗、插条、盆景等生长繁殖材料；来自国内外疫情发生区的上述植物的木材、枝桠、根桩、木片以及它们的制品；来自
8、非发生区违规调运或不具备合法手续的松木及制品等；带有松材线虫及其传播媒介昆虫活体的货物、包装材料、铺垫材料及运输工具。自然界感染松材线虫病的寄主植物和通过人工接种感染此病的植物名录见附录A。5现场检疫51产地检疫511直观检验产地检疫的直观检验主要通过现场踏查的方法进行。用目测方法查找有无死树或针叶褪色和黄化、枯萎变成红褐色并整齐地挂在松枝上，树脂分泌减少直至停止，近期死亡等典型症状的松树，选择抽2GBT 23476-2009样对象。512抽样5121抽样的对象按照GBT 23478-2009中4513执行(参见附录B)。5122抽样时考虑的因素按照GBT 23478 2009中4514执行(
9、参见附录B)。5123抽样的数量按照GBT 23478-2009中461执行(参见附录B)。52调运检疫521现场直观检验5211 直接观察和借助锯、斧等工具检查应施检疫的松木或其加工制品等是否干枯；重量是否明显减轻；木质部是否有蓝变；松脂味是否消失；有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。5212检查松树及其枝条是否有天牛危害、补充营养取食痕迹。522抽样5221抽样比例按照GBT 23478-2009中481执行(参见附录B)。5222抽样方法按照GBT 23478-2009中482执行(参见附录B)。53复检按照52调运检疫执行。6取样方法按照GBT 23478 2009中47执
10、行(参见附录B)。7松材线虫的室内鉴定71松材线虫的分离一般采取贝尔曼漏斗法、浅盘分离法、改进型线虫分离器分离(参见附录C)。72松材线虫的镜检721 当在解剖镜下观察培养皿中的线虫分离液，发现线虫时，挑出(挑取时可选用500 pL移液枪挑取)做成临时水玻片(参见附录D)；或用尖头吸管吸取沉淀管底部分离液13滴，滴于载玻片上，在解剖镜下观察，发现有线虫时制成临时水玻片。722将临时水玻片置于显微镜下观察、测量。73松材线虫的培养当只分离到幼虫或雌、雄成虫数量极少时，可以采用疫木保温保湿或真菌单异括体培养方法快速培养松材线虫(参见附录D)。不具备松材线虫真菌培养基质制作的检疫单位可以委托有无菌培
11、养条件的单位制作。真菌培养基质4冰箱冷藏备用。74松材线虫的形态学鉴定741形态鉴定根据松材线虫成虫的形态特征为鉴定依据对松材线虫进行鉴定。松材线虫成虫形态特征参见附录E。松材线虫的繁殖型幼虫、分散型幼虫和持久型幼虫作为鉴定的辅助特征。742检验记录有关检验情况和鉴定结果填人松材线虫病检验记录表(见附录F)。3GBT 23476-200975松材线虫的分子生物学鉴定分子生物学鉴定不受松材线虫龄期的影响，无须培养即可对松材线虫幼虫进行鉴定。PCR技术作为形态学鉴定的辅助手段，对于鉴定那些形态特征不够典型的松材线虫或拟松材线虫以及幼虫有很大的帮助。具体方法参见附录G。8检疫结果被检样品中未发现松材
12、线虫的，作为签发“植物检疫证书”的依据。被检样品中发现松材线虫的，作为签发“检疫处理通知单”的依据。A1 自然发病的寄主植物附录A(资料性附录)松材线虫的寄主范围GBT 23476-2009奄美岛松Pinus amamiana Kcidzumi、华山松Parmandii Franch、台湾果松Parmandii varmastersiana(Hayata)Hayata、美国短针松Pbanksiana Lamb、白皮松Pbungeana ZuccexEndl、加勒比松Pcaribaea Morelet、瑞士五针松Pcerebra Linn、沙松Pclausa Aarg、小干松Pcontorta
13、Loud、赤松Pdensliflora Siebet Zucc、千头赤松Pdensiflora varumberaclifora、短针松Pechinata Mill、湿地松Pelliottii Engelm、恩氏松Pengelmannii Carr、硬枝展松Pgreggii Engelm、地中海松Phalepensis Mill、卡西亚松Pkesiya Royle ex Gordn、华南五针松P五埘彻g抛ng鲫sis Chun ex Tsiang、光叶松P1eiophylle Schkecht&Cham、硫球松P1uchuensis Mayr、马尾松Pmassoniarla Lamb、米却肯松
14、Pmichoacana Martinez、欧洲山松Pmugo Turra、粗糙松Pmuricata DDon、小干松变种Pmurrayarla(Greville&JH Balfour)Critchfield、欧洲黑松Pnigra Arnold、卵果松Poocarpa Schiede、日本五针松PparvifloraSieb&Zucc、长叶松Ppalustris Mill、展叶松Ppatula Schlechtet Cham、海岸松Ppinaster Ait、西黄松Pponderosa Dou91et Laws、拟北美乔松Ppseudostrobus Lindl、辐射松PradiataDDon、
15、美加红松Presinosa Ait、刚松Prigida Mill、野松Prudis Endl、北美乔松PstrobusLinn、墨西哥白松Pstrobus varchiapensis Martinez、欧洲赤松PsylvestrisLinn、火炬松Ptaeda Linn、黄山松Ptaiwanensis Hayata、黑松Pthunbergii Parl、黄松PthurlbergiiPmassorliana、北美二针松Pvirginiana Mill、胶枞Abies balsamea(L)Mill、北非雪松Cedrus atlantica Manetti、雪松Cdeodara(Roxb)Loud
16、、欧洲落叶松Larix deciduaMill、美洲落叶松L1aricina KKoch、挪威云杉Picea abies(L)Karst、加拿大云杉Pcarladensis(Mill)Britton，Sterns&Poggenb、欧洲云杉Pexcelsa(Lain)Link、白云杉Pglauca(Moench)Voss、黑云杉Pmariana BSP、锐尖北美云杉Ppungens Engelm、红云杉Pr“一bens Sarg、花旗松Pseudotsuga menziesii(Mirbel)Franco。A2人工接种感病的植物海南五针松Pinus fenzeliarla Hand一Mzt、柔松
17、Pflexilis James、光松Pglabra Walt、乔松Pgriffithii McClelland、约弗松Pje，reyi AMurr、红松Pkoraiensis Siebet Zucc、华南五针松Pkwangtungensis Chun et Tsiang、糖松P1ambertiana Dou91、山白松PmonticolaLamb、台湾五针松Pmorrisonicola Hayata、日本五须松Ppentaphylla Mayr、刺针松Ppungens Lamb、晚松Pserotina Michx、类球松Pstrobl：formis Engelm、章子松Psylvestris
18、varmongolica Litvin、油松Ptabulaeformis Carr、云南松Pyunrlaerlsis Franch、平泽银枞Abiesamabilis(Dou91)Forb、日本冷杉Afiwlna Siebet Zucc、巨冷杉Agrandis Lindl、日光冷杉Ahomolepis Siebet Zucc、库叶冷杉 Asachalinensis Mast、日本落叶松Larix kaempferi(Lamb)Cart、西方落叶松Loccidentalis Nuttall、恩格曼氏云杉Picea engelmannii(Parry)Engellm、北美云杉Psitchensis
19、(Bong)Carr、西美山铁杉Tsuga mertensiana(Bong)Carr、黄杉Pseudotsuga douglasii。5GBT 23476-2009附录B(资料性附录)引用松材线虫普查监测技术规程的条款B1松林抽样的对象(见GBT 23478-2009，4513)抽样对象为能够排除非疫病死亡因素(如人畜破坏、森林火灾、其他病虫害)，并表现出松材线虫病典型外部症状的可疑松树。B2松林抽样应考虑的因素(见GBT 23478-2009，4514)B21松材线虫病发病高峰期一般在910月，从表现出针叶变黄、树脂分泌减少甚至停止至死亡约1个月至1个半月。B22在松林中一般是优势木先发病
20、。B23由于松材线虫具有潜伏侵染以及不同松树的抗性差异等原因，一些松树仅部分枝条表现感病外部症状。这种症状在混交林中表现尤其明显。B24抽取样品要及时并重点抽取尚未完全枯死或刚枯死的优势木(针叶呈黄绿或黄褐色，尚未完全枯萎，树皮尚未脱落，材质尚未腐朽)。B25死树的针叶在小枝上下垂倒挂，当年不脱落。B3松林抽样数量(见GBT 23478-2009，461)以林业小班为单位，表现典型症状的松树在10株以下全部取样；10株以上先抽取10株，再选取其余数量的15。B4调运检疫的抽样比例(见GBT 23478-2009，481)B41木材(含原木、锯材)及其制品按货物总量的120抽样，样本数低于10个
21、全检。B42松树、枝条、伐桩按货物的15抽样，样本数低于50个全检。B5调运检疫的抽样方法(见GBT 23478-2009，482)B51木材(含原木、锯材)及其制品、枝条、伐桩，采取表层或分层方式设点抽样检查。B52抽取密度明显减轻和(或)有蓝变特征或有天牛危害症状的树木、枝条、木材(含原木、锯材)及其制品。B6取样方法(见GBT 23478-2009，47)B61松林取样B611一般情况下在树干下部(胸高处)、上部(主干与主侧枝交界处)、中部(上、下部之间)3个部位取样。如仅部分枝条表现症状的，要在树干上部和死亡的枝条上取样。如外部表现症状明显的可在胸高处取样。在春季松褐天牛化蛹期，可在蛹
22、室周围取样。B612取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100 g200 g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部至髓心钻取100 g200 g木屑；或在取样部位分别截取2 cm厚的圆盘。B613所取的样品要及时贴上标签(记录样品号、采集地点、树种、树龄、取样时间和取样人等)。B62松木及制品取样B621选择截面无松脂痕迹、密度明显减轻和(或)木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室的6GBT 23476-2009松木及制品进行取样。B622原木取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100 g200 g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部至髓心钻取100 g200 g木屑；或在取样部位分别截取2 cm厚的
23、圆盘。B623锯材和松木制品取样时直接砍取i00 g200 g木片；或用手摇钻从木质部取i00 g200 g木屑。B624 所取的样品要及时贴上标签(记录样品号、采集地点、材种、制品类型、取样时间和取样人等)。附录c(资料性附录)松材线虫的分离C 1 贝尔曼漏斗法分离线虫在直径10 cm15 cm的漏斗末端接一段长约10 cm的乳腔管后置于漏斗架上，井在乳胶管上装一止水夹，然后在漏斗上铺大小适当的两层纱布；分离术屑时，两层纱布之问放i张纸巾。 将带回宴验室的样术去皮后劈成长约34 cm，直径23mm的细条，约取i0 g(或木屑)置于漏斗中的纱布上，将纱布四角向中间盖上分离材料，然后向漏斗内注人
24、清水至裎擞，并挤捏。注人清水后要注意使水克满漏斗和下面的乳腔管，乳胶管内不得有气泡。见图e i。2线m滤3，4。图c 2贝尔曼浅盘法分离线虫装置圈GBT 23476-2009C3改进型线虫分离器法改进型线虫分离器分离线虫，兼顾漏斗法和浅盘法各自的优点。分离器由一只网筛、乳胶管、止水夹和一次压模成型的主体构成(图c3)。在筛网上放两层纱布，再将木屑或劈好的小木条放在上面。从网筛外缘加水至样品水平的位置。在2030下放置12 h后，打开止水夹，用离心管接取约5 mL分离液；静止自然沉淀30 rain或1 500 rrain离心2 min，吸去离心管内上清液，获得浓度较高的线虫悬浮液供镜检。1样品；
25、2线虫滤纸3筛盘；4基座；5橡胶管；6止水夹。图c3改进型漏斗分离松材线虫装置示意图GBT 23476-2009D1 疫木保温保湿培养附录D(资料性附录)松材线虫的快速培养和临时玻片的制作将样品锯成小段，置于烧杯中加少量清水，木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在30条件下保温保湿培养3 d，倒取杯中水液，可获得较多雌雄成虫；或将样品木段适当浸湿，放于塑料袋里，扎紧袋1：3，置于30培养箱中3 d取出重新分离，可获得较多雌雄成虫。或从干净的松木板材锯出一些木屑，装进盘尼西林瓶里，然后将幼虫移至木屑里，放在培养箱30培养3 d5 d，将木屑中的线虫分离出来。D2单异活体培养制备马铃薯一葡萄糖
26、一琼脂(PDA)培养基平板。用盘多毛孢(Pestalotia spp)或廉刀孢(Fusariumspp)或灰葡萄孢(Botrytis cinerea)培养线虫。无菌条件下将多毛孢或镰刀孢或灰葡萄孢接种在PDA平板上。多毛孢或镰刀孢28恒温培养4 d5 d，待培养完成后可长期置4冰箱冷藏备用；而灰葡萄孢25恒温培养4 d5 d，茵丝长满平板备用。发现可疑幼虫时，取适量菌丝块放小培养皿中，恢复至室温接种线虫。多毛孢或镰刀孢在30恒温条件下保湿培养线虫；接种20条幼虫，48 h即可分离鉴定；线虫量少时可相应延长培养时间。而灰葡萄孢在25恒温培养线虫，培养时间要加长1 d3 d。D3临时水玻片的制作D
27、31 在洁净的载玻片中央滴一水滴，水滴的量以加盖玻片后恰好充满盖玻片下的空间为好。D32用细针挑取或用毛细滴管吸取线虫，置于载玻片的水滴中，并使之沉底。D33将有线虫的载玻片在酒精灯的火焰上往返通过5 s6 s，杀死线虫。D34用细针摆好水滴中的死线虫，然后用镊子夹盖玻片从一侧轻轻盖下。D4半永久玻片的制作将分离所得的线虫液，转移至离心管中，2 000 rrain离心3 rain。吸去上部清水并保留底部3 mL4 mL线虫液，置于53热水中15 rain杀死线虫，待冷却后，加入等体积的TAF液固定48 h以上。再用上述方法再离心，用5 pL微量移液器吸取离心管底部线虫液，滴加进装有2 mL棉蓝
28、一乳酚油的钟面皿中，置恒温烘箱中45脱水24 h。在载玻片上加上封片蜡圈，用挑针加一小滴甘油于蜡圈中心位置。解剖镜下挑取脱水后的目标线虫于甘油中，使其沉底并位于甘油滴中心位置。在封片蜡圈上放置盖玻片后，转移至控温电热平板上，保持75使蜡完全融化，取下并自然冷却后用透明指甲油加封一次。在显微镜下鉴定并确认为松材线虫后贴上标签，注明松材线虫的虫龄、数量、寄主、寄主产地、截获口岸及鉴定人。附录E(瓷料性附录)松材缝虫的形态特征E 1成虫特征雌雄成虫均呈蠕虫形，虫体细长，约1 mm。头部居区高，缢缩明显，日针细长，基部略微增厚。中食道球卵圆形，占体宽的213以上，食道腺细长叶状，覆盖于肠背面。排泄孔的
29、开口大致与食道和肠交接处平行，半月体在排泄孔后约23体宽处。雌虫尾部亚圆锥形，末端钝圆，少数有微小的尾尖赛。卵巢前伸，卵呈单行排列t阴门开口于虫体的中后郡73处，上覆以宽的阴门盖。雄虫交合刺大，弓状，喙突显著，远端膨大如盘状。雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲尾端为小的卵形交合伞所包裹。橙材线虫成虫形态特征圈见图E 1。lm2雄m，3雄虫月部I4女月面n(尾端i空音牵)I5盘舍刺腹观，6雌m前部7$目1，810虫月部；11橙#线虫月部w种形状(A赦，j、月尖*B月*目)。围E 1松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(Steiner et Buhnr)NickleGUT 2347
30、6-2009E 2幼虫特征分散型3龄幼虫(L口)体内内古物增加导致体色较深。尾部呈半圆形，与其他龄期幼虫相比更宽、钝。2龄至4龄幼虫在形态上以体长和生殖腺长度进行区别。E 3松材线虫与近缘种拟松材线虫形态特征的主要区别拟松材线虫Bm”cronatus(Mamiya et Enda)在形态学和生物学方面均与橙材线虫相似，但分布较橙材线虫广泛，在橙材线虫病的检验中常常可见，二者在形态上的主要区别在于：a)雌虫尾部，橙材线虫为亚圆锥形，末端钝圆，少数可见微小的尾尖突，不超过z p旷般为1蹦拟松材线虫为圆锥形，末端有明显的尾尖突，长度在3 5 1xm以上t一般为5 pm。b)罐虫尾部，松材线虫交合刺远
31、端有盘状突，交合伞为卵形；拟橙材线虫交舍剌远端无盘状突，交舍伞为近方形。拟橙材线虫形态特征图见图E 2。45n自部6雄月部7交舍伞I8月尖囊图E 2 拟松材线虫口删nj(M日mi”d Enda)。，M附录F(规范性附录)松材线虫病检验记录表表F1 松材线虫病检验记录表GBT 23476-2009样品 检验日期 松脂味 松褐天牛 镜检有无松材批号 样号 干枯 蓝变 备注 检验人来源 (年、月、日) 消失 栖居痕迹 线虫(+、一)13GBT 23476-2009G1线虫基因组DNA的提取附录G(资料性附录)松材线虫PCR检测G11 少量线虫(含单条线虫)DNA提取按照每条线虫，加入10 pL预冷的
32、线虫裂解液比例，将线虫与裂解液置于Eppenddorf管中。在PCR仪上，于70条件下保温处理35 rain。在95条件下保温处理10 rain。12 000 rrain离心2 min，上清液用于扩增。G12大量线虫DNA提取取线虫群体200 pL于Eppendorf管中，加入300 pL线虫裂解液(200 mmolL TrisHCI、200 mmolLNaCl、100 mmolL EDTA、2SDS、2pmercaptoethanol、200xgmL蛋白酶K)，混匀；在65水浴中处理1 h，每隔10 min摇荡一次；用等体积(500 pL)的酚、酚一三氯甲烷一异戊醇(25+24+1)、三氯甲
33、烷一异戊醇(24+1)抽提，4条件下，12 000 rrain离心20 min，取上清液；在上清液中加入110体积的3 molL的乙酸钠(pHi46)和两倍体积的无水乙醇(一20)，在一70条件下30 rain；12 000 rmin离心20 rain，沉淀用70的乙醇(一20预冷)洗涤两次，沉淀气干15 h，加入100 pLTE重新悬浮沉淀；取10 pL稀释250倍，用紫外分光光度计测定DNA的浓度(DsDNA一50(OD2s。一On。)稀释倍数(pgmL)；用灭菌蒸馏水将各DNA提取液稀释到20 ngpL，作为PCR扩增的模板DNA，一20备用。G2 PCR扩增G21 PCR引物松材线虫特
34、异引物组合B。G22反应体系G221普通Taq酶每反应的混合液总体积为20止，其中：a)20止10PCR缓冲液：05 molL的KCI；100 mmolL TrisHCl，pH一90；1TritonX一100；b)2 pL 25 mmolL的dNTP；c)18 pL 25 mmolL的MgClz；d)02 pL 5U1LTaq酶；e)15ILLlommol的引物组合B；f)20 pL 20 ngmL的模板DNA；g)补充高压灭菌重蒸水至20 pL。G222快速扩增Taq酶每反应的混合液总体积为20 pL，其中：a)20 pLlo快速Taq PCR缓冲液；b)2 pL 25mmolL的dNTP；
35、c)03 pL快速扩增Taq酶；d)15ILlommolL的引物组合B；e)20 pL的模板DNA；】4f)补充高压灭菌重蒸亦至20 pL。G 2 3反应程序G23I普通Taq醢反应混合液在95预变性3 min，进人循环95变性15 s，52退火30 s，72延伸50 5，共40个循环，最后72延伸7min。G 2 3 2快速扩增Taq酶反应混合液在98预变性5 st进人循环98变性3 s，52退火3 s，72延伸40 s，共30个循环，最后72延伸2rain。G 3结果检测PCR扩增产物在1 5的琼脂糖凝胶上电濠，电最缓冲澈为lTAE或1TBE，电压为5 Vcm，电泳时间为30 rain。置凝腔于302 nm透射紫外灯上观察、拍照。结果参见图Gi、图G 2濂女M-标DNA；l35橙材线虫；3643M#材拽自4446线虫束定种圈G I松材线虫特异引轫组台B对大量线虫检剐图谱豫道M标准DNA；4749橙材绕i，5052橙材缠图G 2松材线虫特异引物组合B对少量线虫检测图谱
