1、i才中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1109- 2002 新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程Procedure of haemagglutination-inhibition test for Newcastle disease 2002 - 05 -20发布2002 -11-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局SN /T 1109-2002 前本标准等效采用国际兽医局的标准诊断方法和疫苗标准手册)(2000年，第四版)，并参考中华人民共和国进出境动物检疫规程手册编写、制定。本标准的附录A、附录B为标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起
2、草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:胡永强、单松华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准范围新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程Procedure of haemagglutination-inhibition test for Newcastle disease 本标准规定了禽类新城疫微量红细胞凝集抑制试验方法。本标准适用于禽类新城疫红细胞凝集抑制抗体水平的检测。2 引用标准SN/T 1109-2002 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标
3、准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。国际兽疫局诊断方法和疫苗标准手册)(2000年，第四版)3 仪器设备、试荆和材料所有试剂均为分析纯。3.1 器材普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50L可调移液器、恒温箱、塑料采血管等。3. 2 试剂磷酸二氢铀、磷酸氢二铀、氯化铀、葡萄糖、拧棱酸铀、蒸馆水。3. 3 稀释液pH7.0或至pH7.4 o. 01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录A标准的附录)。3.4 新城疫标准抗原由指定单位供应，或用标准新城疫(ND)毒株尿囊腔接种911日龄元特定病原体(SPF)鸡胚，收集尿囊液灭活制备抗原。3. 5 1%鸡红细胞采
4、集SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放入等量的阿氏液(见附录B标准的附录)中，用20倍体积的PBS洗涤34次，每次以2000r/min离心34min，最后一次5min，用PBS配成1%悬掖。4C保存悬液，在72h内使用完。3. 6 血清3. 6.1 标准阳性/阴性血清:由指定单位供应。3. 6. 2 被检血清:采、送的样品。样品以1000 r/min离心5min，吸出血清待用。若需较长时间保存血清，可置于40C或一20C。中华人民共和国国家质量监督检验检擅总局2002-05-20批准2002 -11-01实施1 SN/T 1109- 2002 4 操作方法4. 1 微量血凝试验(见表1
5、)表1微量血凝试验操作术式单位:L孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 滴度(Iogz)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 对照PBS 25 25 25 抗原(倍比稀释25 25 25 PBS 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 作用时间及温度180C20C ，静置40min左右判定举例+十十十+十+十十+十+十+十十+十十十十十十十+ 4. 1- 1 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25LPBS，共加四排。4.1.2 吸取一定倍
6、数稀释的抗原25L加于第1列孔，充分混合后移出25L至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25L。4.1.3 设立第12列孔为红细胞对照。4.1.4 每孔再加25LPBS。4. 1- 5 每孔各加入1%鸡红细胞悬液25L。4.1.6 立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。4.1.7 置3TC静置15min20 min，或室温(l8C250C)静置40min左右，或4C静置60min(如果环境温度太高时)。4.1.8 结果判定:期间观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀(此时为一个圆点)。将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结果。HA效价
7、高于211时可继续增加稀释的孔数。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度(红细胞无泪珠样流挂)，该血凝滴度代表了一个血凝单位，再根据初始稀释度计算抗原的血凝单位。4.1.9 4个血凝单位的标定:根据4.1.8测定的抗原的血凝效价，计算4个血凝单位抗原的稀释倍数。方法举例为:如抗原HA效价为27，其4个单位抗原HA效价为25，则将抗原稀释32倍即可。将25L含4个血凝单位的抗原用PBS做等量倍比稀释，使每孔(25L)含有4、2、1、0.5个血凝单位，再加入1%鸡红细胞25L，判定血凝图像与预期结果是否相符合。4、2、1个血凝单位孔红细胞应出现完全凝集，0.5个血凝单位孔红细胞应出现50
8、%凝集。若不相符，须按4.1.14.1.8法重新进行。4.2 微量血凝抑制试验(见表2)表2微量血凝抑制试验操作术式单位:L孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 滴度(Iogz)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PBS 25 25 被检血清倍比稀释25 25 4血凝单位抗原25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 作用时间及温度18C250C ,30 min60 min 1%鸡红细胞悬液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 作用时间及温度180C250C ，静置40min左右判定举例卜J工卜
9、u+吐十土iiJ土+十土|2 SN/T 1109-2002 4.2.1 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25LPBS。4.2.2 吸取被检血清25L于第1列孔，混匀后由左向右顺序倍比稀释至第12列孔，最后弃去25L。4.2.3 第1列孔至第12列孔分别加25L含4个血凝单位的抗原。4.2.4 立即置微型振荡器上海合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。4.2.5 在室温下，(18C25C)至少感作30min，或在4C至少感作60mino 4.2.6 每孔加1%鸡红细胞悬液25L;混合后置室温下(18C25.C)40min左右，或在40C60min (如果环境温度太高时)，此时对照的红
10、细胞已沉淀为一个圆点。4.2.7 每次测定须设已知滴度的阳性血清、阴性血清(SPF鸡血清)和红细胞对照(仅含25L1%鸡红细胞和50LPBS)。4.2.8 结果判定4.2.8.1 检查各种对照。阴性血清血凝抑制滴度不得超过22，阳性血清血凝抑制滴度与己知滴度不得相差一个滴度以上。红细胞对照元血凝现象。4.2.8.2 在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。4.2.8.3 被检血清1: 16(2)或更高稀释度的孔出现红细胞凝先完全抑制时，判为阳性。3 SN/T 1109-2002 附录A(标准的附录)磷酸盐辑:中液的配制A1 pH7.0或至pH7.40
11、.01 mol/L磷酸盐缓冲液CPBS)的配制。A1.1 0.2 mol/L磷酸氢二铀和0.2mol/L磷酸二氢铀的配制(见表A1)。表A10.2 mol/L磷酸氢二锅0.2 mol/L磷酸二氢纳磷酸氢二纳(2H20)磷酸氢二钩。2H20)磷酸二氢销(H20)磷酸二氢饷(2H20)35. 61 g 71.64 g 27.6 g 31. 21 g 水1000mL 水1000mL 水1 000 mL 水1 000 mL 注:121C高压蒸汽灭菌15min , A1.2 0.2 mol/L磷酸缓冲液CPB)的配制(100mL) C见表A2)。表A2pH 0.2 mol/L磷酸氢二纳，mL0.2 mo
12、l/L磷酸二氢纳，mL7.0 61. 0 39. 0 7.2 72. 0 28. 0 7.4 81. 0 19.0 L一一一一一一按所需pH值查表，按体积比例混合二液，即为0.2mol/L PB储存液。A1.3 0.85%氯化铀的配制氯化铀8.5g加蒸馆水至1000 mL , A1.4 pH7.0或至pH7.4 O. 01 mol/L PBS的配制4 以0.85%氯化铀溶液将储存液稀释20倍即得工作液。121 C高压蒸汽灭菌15min.置室温或4C保存。B1 阿氏液(红细胞保存液)葡萄糖2.05 g 拧攘酸纳(2HzO)0.80 g 氧化铀0.42 g 蒸锢水加至100mL SN /T 110
13、9 - 2002 附录B(标准的附录)阿氏渣的配制溶解后，以10%拧棱酸调节pH至6.1，分装，121cC高压蒸汽灭菌10min灭菌，4C保存。5 NOON-gFF 同Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准新城瘦微量红细胞提集抑制试验操作规程SN/T 1109-2002 4峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷部开本880X12301/16 印张3/4字数10千字2002年9月第一版2002年9月第一次印刷印数1-2 000 J1J 号定价8.00网址书号:155066 2-14714 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1109-2002
