1、户:才己|中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN /T 1129. 1-2002 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程Protocol of serum neutralization micro test for bovine viral diarrhea/mucosal disease 2002 - 08 -02发布2003-0个01实施中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局发布SN/T 1129.1-2002 目。吕本标准试验方法是参考国际兽疫局诊断试验和疫苗标准手册介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家
2、认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张晓丁、苏卫、王涛、李凌枫。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。范围牛病毒性腹泻/粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病微量血清中和试验方法。本标准适用于动物牛病毒性腹泻/粘膜病中和抗体的检测。2 规范性引用文件SN/T 1129.1-2002 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的可|用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注
3、日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和实验方法3 缩略语下列缩略语适用于本标准。CPE 细胞病变作用。TCID50 半数组织培养感染量。BVD/MD 牛病毒性腹泻/粘膜病。4 原理动物感染BVD后，能在体内产生特异性中和抗体。这种特异性中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现中和一定数量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。血清中和试验以测定病毒的感染力为基础，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，所以必须选用对病毒敏感的
4、细胞为实验材料，以保证实验的准确性和敏感性。5 试剂和材料5. 1水本标准所用水应符合GB/T6682-1992中二级水的规格。5.2 病毒BVD病毒OregonCZ4V株。5. 3 对照血清5.4 被检血清在无菌条件下采取血样，分离血清。5. 5 细胞试验所用的细胞为牛鼻甲骨传代细胞也T)、胎牛(或棋牛)鼻甲骨原代细胞、牛肾传代细胞(MDBK)、胎牛(或棋牛)肾原代细胞、胎牛或棋牛辜丸细胞。按常规膜酶消化方法制备(所用棋牛应无1 SN/T 1129.1-2002 BVD污染)。5.6 本标准所用溶液配方(包括培养液、维持液、稀释液、细胞分散液)及配制方法见附录A。6 器械和设备6. 1 倒置
5、光学显微镜6.2 微型振荡器6.3 二氧化碳培养箱6.4 冰箱:一20C保存血清，一70C保存种毒。6. 5 96孔组织培养板6. 6 单头和多头微量移液器(20L200L)及滴头7 种毒繁殖将BVD病毒OregonC24V株接种到细胞单层，3TC吸附1h后加入维持液，置3TC培养，逐日观察。待CPE达75%以上，收获病毒培养物冻融，2000 r/min离心20mino取上清液分装小瓶，每瓶1 mL，置一70C保存备用。8 毒价测定将病毒在96孔板上作(lOO10-10)倍稀释，每个稀释度接种8孔，每孔病毒悬液为50L，补充50L稀释液，加入细胞悬液100L(3X 105个细胞/mL)，每块板
6、设8孔细胞对照。置5%COz培养箱于37C培养，于4d6 d逐日在倒置显微镜下观察记录CPE。按Karber方法计算出病毒的TCIDso/50L值。根据测定结果将病毒液稀释成100TCID50/50L的工作浓度。9 试验程序9.1 灭活BVD标准阳性血清、阴性血清、被检血清经56C, 30 min灭活。9. 2 对照设立细胞对照:设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100L、稀释液100L。一一一病毒回归对照:将工作浓度的病毒液进一步10倍稀释成100、10、1、O.1 TCID50/50L，每个稀释度接种2孔，每孔加入病毒悬液50L，再加入细胞悬液100L，每孔补充稀释液50L。一一阳性对照:
7、设4孔阳性血清对照，每孔分别加入阳性血清和100TCID;o/50L病毒悬液各50L，再加入细胞悬液100L。一一阴性对照:设阴性血清对照4孔，每孔分别加入阴性血清和100TCIDso/50L病毒悬液各50L，再加入细胞悬液100L。一一血清毒性对照:每份被检血清按稀释度各设1孔毒性对照，每孔加各稀释度血清50L、稀释液50L和细胞悬液100L。9.3 中和试验根据试验需要，将被检血清从1: 2开始作倍比系列稀释，每个稀释度加三孔，每孔加已稀释血清50L，第一孔作为血清毒性对照孔，加入稀释液50L和细胞悬液100L;第二、三孔为试验孔，每孔加入100TCID旷50L的病毒悬液50L，振荡2mi
8、n3 min，置37C二氧化碳培养箱中和1h，然后加入细胞悬液100L置5%二氧化碳培养箱于37C培养6d，逐日观察CPE并记录。2 SN/T 1129.1-2002 10 结果判定当病毒对照滴度为100(30 300)TCID50/50L时，阳性血清能完全抑制BVD病毒的CPE，阴性血清完全不能抑制BVD病毒的CPE，细胞对照孔和血清毒性对照孔内的细胞生长正常时，才能进行结果判定。判定时间为4d6 d，逐日记录CPEo当被检血清的某一稀释度出现50%以上被保护时，该血清的稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。3 SN/T 1129.1-2002 A.1 培养班附录A(规范性附录)溶液配制199培
9、养基(也可用MEM或其他培养基)，加入10%无BVD病毒抗体胎牛血清(560C, 30 min灭活)，含青霉素200IU/mL，链霉素200g/mL，抽滤除菌。置一20C保存备用。A.2 维持液199培养基(也可用MEM或其他培养基)，加入2%无BVD病毒抗体胎牛血清(56C，30min灭活)，含青毒素200IU/mL，链霉素200吨/mL，抽滤除菌。置一20C保存备用。A. 3 细胞分散瑕膜酶2.50 g 乙二胶囚乙酸二饷(EDTA)0.20 g 无钙镇离子PBS液1 000 mL 抽滤除菌分装，置一20C保存备用。A.4 无钙镶PBS氧化饷8.0 g 氯化饵0.2 g 磷酸氢二铀1.15
10、g 磷酸二氢铀0.2 g 水1 000 mL 将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌(68.94kPa 15 min)或抽滤除菌，置4C保存备用，有效期为一年。A.5 Hanks液A. 5. 1 10倍Hanks母液的制备A液:氧化铀氯化押氧化钙硫酸镜(7H20)水B液:磷酸氢二铀磷酸二氢梆水C液:1%酣红80.0 g 4.0 g 1. 4g 2.0 g 450 mL 0.6 g 0.6 g 450 mL 16 mL 将上述成分依次溶解，将B液慢慢加到A液中，同时不断搅拌，再加入C液，补充水至1000 mL。抽滤除菌或高压灭菌(103.41kPa 10 min)。置c保存备用，有效期为3个月。A.
11、 5. 2 Hanks使用液的制备4 10 倍Hanks母液一级水500 mL 4 500 mL SN/T 1129.1-2002 将母液加到水中，摇匀分装。抽滤除菌或高压灭菌(103.41kPa 10 min)。置4CC保存备用，有效期为3个月。使用前每1000 mL加1.4%碳酸氢铀25mL。A.6 1. 4 %碳酸氢铀溶液碳酸氢铀一级水14.0 g 1 000 mL 分装抽滤除菌，置一20C保存备用，有效期为6个月。A.7 1 %酣红酣红1 mol/L NaOH 水1. 0g 约7mL 总量到100mL 将酣红放于乳钵内加少量1mol/L氢氧化饷研磨使其完全溶解，氢氧化饷加得越少越好，分
12、装高压灭菌(68.94kPa 10 mi口)，置室温或4C保存备用。A.8 消化液(0.25%膜酶Trypsin)膜酶2.5 g Hanks使用液1 000 mL 分装抽洁、除菌，置一20C保存备用。5 NCC时|F.dhFF同Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛病毒性腹泻/粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程SN/T 1129.1-2002 美中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷导开本880X12301/16 印张3/4字数12千字2002年11月第一版2002年11月第一次印刷印数1-20007c 当&定价8.00网址书号:155066 2-14748 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1129. 1-2002
