1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1166.3-2006 水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) for vesicular stomatitis virus 2006-01-26发布060712000121 2006-08-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前SN/T 1166分为三部分:一一水泡性口炎补体结合试验操作规程;水泡性口炎微量血清中和试验操作规程;一一水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程。本部分为SN/T1166的第3部分
2、。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本部分起草单位:中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本部分主要起草人:花群义、周晓黎、徐自忠、董俊、杨云庆、龙忠保。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1166.3-2006 I SN/T 1166.3-2006 水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程1 范围SN/ T 1166的本和定型检测方法。本部分适用于水2 规范性引用文件协议的各方研究是否可使用这些部分。GB/ T 6682 3 试剂和材料3. 1水应符合GB/T668 3. 2 试剂纯度所有的化学试剂均为分析纯。3.3 水泡
3、性口炎病毒标准株3.4 Taq酶200C保存，避3.5 逆转录酶AMV200C保存，避免3.6 RNA抑制荆(R-200C保存，避3.7 dNTP 含dCTP、dGTP、3. 8 引物3. 8.1 该试验选用水泡方法，半套式引物分别根据TTC 安那型CIND)的RT-PCR定性、检疫和监测。本部分的条款。凡是注日期的引用文适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本扩增区。采用半套式RT-PCR夕卡侧引物II(P2) :5 TGA TTC AAT ATA ATT AT T TTG GGA C 3 NJ半套式引物(P3):5 TGT TCT GGT GTG CA
4、A ACC AGG TAT C 3 IND半套式引物(P4):5 AGT AGA ACT GTG CAA GCC CGG TAT C 3 3.8.2 用DEPC水将引物配制成浓度为25pmol/L。3.9 异戊醇使用前预冷到200C。SN/T 1166.3一20063. 10 矿物油要求无DNA酶和RNA酶。3. 11 变性液、抽提液1、抽提渣2、5倍逆转录酶缓冲液、TBE电泳缓冲液、10倍Taq酶缓冲遣、EB核酸染色渡、上样缓冲渡、DEPC处理水配制方法见附录A。4 器材和设备PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶图像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱和低温冰箱、电动匀浆器或组织研磨器、离心
5、机和离心管。5 操作方法5. 1 被检样晶的采集和处理5. 1. 1 被检样晶的采集样品主要采集动物口、蹄冠上或乳头上的水泡上皮组织，采集后立即冷藏送检或置缓冲甘油(用0.01 mol/L pH7. 2的PBS配制的50%的甘油溶液)中低温保藏;采集到的水泡液置灭菌瓶中，冷藏送检或低温保藏;若从冻肉中采样，可采集淋巴结或组织;采集的精液样品应不少于1mL，冻精样品每头每批次取样3管5管;无症状或无水泡的活动物采集抗凝全血;胚胎及其冲洗液;细胞培养物。5.1.2 被检样晶的处理5. 1.2. 1 将采集到的上皮、淋巴结或组织样品，经研磨后用0.01mol/L pH7. 2的PBS配制成20%的悬
6、液。精液用乳糖蛋白陈缓冲肉汤(BLP，配制见附录A第A.I0章)作1: 5稀释后，经11000 r/min 低温离心30min，弃上清液，并弃去浮游脂肪，再用BLP作1: 5稀释成悬液;全血、胚胎及其冲洗液、细胞培养物元需处理。5.1.2.2 取450L样品悬液放入1.5 mL的离心管，再加人450L变性液并混匀，旋涡振荡混合20 s，冰陷15min。5.2 对照样晶制备和处理5.2. 1 阳性对照样晶制备将水泡性口炎病毒NJ型和IND型分别接种BHK-21或Vero细胞单层，37.C吸附1h后加入维持液，置5%二氧化碳培养箱37.C培养，逐日观察。待CPE达75%以上，冻融两次，收获细胞培养
7、病毒悬液，分装成1mL小瓶，置一70C保存备用。5.2.2 阴性对照样晶制备制备BHK-21或Vero细胞单层，弃去细胞培养液，加入维持液，置5%二氧化碳培养箱37.C培养3 d，冻融两次，收获细胞悬液，分装成1mL小瓶，置一70.C保存备用。5.2.3 对照样晶的处理取450L阳性和阴性对照样品细胞悬液放入1.5 mL的离心管，再加入450L变性液并氓匀，旋涡振荡混合205，冰浴15min。5.3 RNA抽提在含有样品的1.5 mL离心管中加人600L抽提液1，用力混合至少30504.C下12000r/min离心5min，小心取上层水相(约800L)放入一新的1.5 mL离心管。再加入700
8、L抽提液2，用力混合至少308 0 40C下12000r/min离心5min.小心取上层水相(约600/L)放入一新的1.5 mL离心管。再加入20.C预冷的1.5倍体积的异戊醇(约900L).倒置数次提匀后，200C1 h以上沉淀核酸。40C下12000 r/min离心30min.小心弃去上清。加入1mL 75%乙醇，充分混匀，40C下12000 r/min 离心30min，小心弃去上清。室温干燥20min后，加11L水榕解，用作反转录模板。也可采用等效的商品化病毒RNA提取试剂盒制备RNA样品，具体操作按说明书进行。2 SN/T 1166.3-2006 5.4 逆转景合成cDNA在PCR管
9、中加入10L逆转录模板(样品RNA)、1L引物P2、5L5倍逆转录酶浓缩缓冲液、2LdNTP、0.5LRNA酶抑制剂(20U)、1L逆转录酶AMV(10U)和O.5L水，总体积为20L。置于42.C逆转录45min，立即冰浴，用作PCR模板。5.5 PCR扩增DNA5.5.1 PCR反应液组成10倍Taq酶用浓缩缓冲液25 mmol/L的氯化模dNTP 引物P1引物P25L 8L 6L 1L IL Taq酶(5U) 1L cDNA模板5L 灭菌水23L 总体积为50L，每管加入50L矿物油(带热盖功能的PCR仪不加矿物油)，3000 r/min离心10 8，让矿物油集中在上层。5.5.2 PC
10、R反应程序将PCR反应管置于PCR扩增仪。先94.C5min，再进行94.C45 8、55.C458、72.C1 min，30次循环，然后72.C8min，最后4.C保温。5.6 PCR产物琼腼糖电泳用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含O.5g/mL EB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将8L样品和2L样品缓冲液混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用pUC19DNA/M8p 1 (Hpa 11). 5 V /cm电泳约30min，当澳酣蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察有无227bp的DNA片段扩增产物条带。5. 7 半套式PCR定型5.7.1
11、PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，如果看不到227坤的DNA条带，取5L产物做模板;如果电泳后能看到227bp的DNA带，只是要求进行定型，则需将产物按1: 1 000稀释后，取5L做模板。5.7.2 取2个离心管，一管作新泽西型(N)，另一管作印第安那型CIND)。5.7.2. 1 在新泽西型(N)PCR反应管中依次分别加入以下试剂z模板(PCR产物)5L、Taq酶1L(5 U)、dNTP2L、引物P21L、引物P3(N型)1L，10倍用浓缩的Taq酶缓冲液5L，25mmol/L 的氯化镜(MgC12)6L、加水(29L)到总体积为50L。每管加入50L矿物油(带热盖功能的PCR仪不加)，短时间低
12、速离心让矿物油集中在上层。5.7.2.2 在印第安那型(lND)PCR反应管中依次分别加入以下试剂:模板(PCR产物)5L、Taq酶1L(5 U)、dNTP2L、引物P21L、引物P4(lND型)1L，10倍用浓缩的Taq酶缓冲破5L，25 mmol/L的氯化镜(MgC12)6L、加水(29L)到总体积为50L。每管加入50L矿物油(带热盖功能的PCR仪不加)，短时间低速离心让矿物油集中在上层。5.7.3 将反应管置于PCR扩增仪。先94.C4min，再进行94.C308、55.C458、72.C458，30次循环，然后72.C5min，最后4.C保温。5.7.4 如同5.6，用TBE电泳缓冲
13、液配制2%的琼脂糖(含0.5g/mLEB)平板进行电泳检测。5.8 设立对照5.8.1 从5.3RNA抽提开始，就必须设立阳性对照、阴性对照。以含有己知新泽西型(N)和印第安那型CIND)病毒株的细胞悬液作为阳性对照，用正常的BHK21或Vero细胞悬液作为阴性对照。5.8.2 只有在对照成立的情况下，试验有效，可进行结果判定。3 SN/T门66.3-20066 结果判定6. 1 PCR后阳性对照会出现一条227bp的DNA片段。阴性对照没有该核酸带。6. 2 半套式PCR后，与引物相应的血清型病毒的阳性对照会出现一条119bp的DNA片段。阴性对照没有该核酸带。6.3 待测样品PCR扩增后，
14、如能在相应227bp DNA位置上有带，即可作出定性。半套式PCR后如出现一条119坤的6. 4 必要时对扩增产4 A. 1 变性液拧攘酸铀十二皖基肌氨酸铀-琉基乙醇异硫氨酸肌灭菌三蒸水A.2 抽提液1A.3 抽提液2将三氯甲皖:异戊醇按24A. 4 TBE电谏缓冲液(5倍浓Tris 棚酸(H3B03)EDTA 去离子水用5mol/L的盐酸调到pH8.0A. 5 AMV逆转录酶的5倍浓缩Tris-HCl 氯化拥(KCl)氯化镇(MgClz)DTT A.6 Taq酶用10倍浓缩缓冲Tris-HCl 氯化伺(KCl)TritonX-100 A. 7 EB(滇Z淀)核酸染色液附录A(规范性附录)试剂
15、配制。164 g &;5 g 0:佛8.ttiL27 . 5 g 2. 922 g SN/T 1166. 3- 200 6 4 : 1混合，密闭避光保存。用水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每100mL琼脂中加10L。A.8 上样缓冲液每100mL水溶液中含:澳酣蓝0.25g，煎糖40g。5 SN/T 1166.3-2006 A.9 0.01 mol/L pH7. 2的PBS磷酸氢二饷(NazHP04)磷酸二氢饷(NaHzP04)氯化铀(NaCD去离子水112 kPa高压灭菌20min，4C保存备用。A.10 乳糖蛋白腺缓冲肉汤(BLP)A. 10. 1 甲液磷酸二氢铀(NaHzP04)去离
16、子水A. 10.2 乙液磷酸氢二铀(NazHP04)去离子水A.10.3 工作液甲液乙液蛋白陈乳糖112 kPa高压灭菌15min或抽滤除菌。A.11 DEPC 7.! 1. 19 g 0.22 g 8. 50 g 1000 mL 4.60 g 500 mL 9.40 g 1000 mL 220 mL 780 mL 2.00 g 100 g 取1mLDEPC(焦碳酸二乙醋加入1000mL去离子水中，370C过夜，112kPa高压灭菌30min。6 附录B(资料性附录)扩增片段序列(227bp/119 bp) 1 ggaaacaaaa agatggtcac gagtgacatg tgttacaa
17、at gatcaaattc cgacatgtgc 61 taa tttga tg tcttcagtct ctactaa tgc a ttaacggtt gcacactttg cagaaagccc 121 tataaacgca atgattcaat ataattattt tgggaccttt gctcgattat tgctctttat 181 gcatgaccct gcaataagac aatctctgta tacagtcaag gaaaagatac ctggtttgca 241 caccagaaca ttcaaatacg ctgtattata tctagatcct tcaatcggag ggg
18、aatgtgg 301 tatggcgttg tctcgattct taatcagagc ttttccagat ccggaaacag agagcctttc 361 attctggaaa tttatttatg aacatgctcg gagcctccat cttaaaaaga tggctgtaat 421 gtttggggac cttccaattg ccaaattcag aatagagcat atcaataagt tattagagga SN/T 1166.3-2006 CON-m.g=H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程SN/T 1166.3-2006 峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷晤开本880X12301/16 印张O.75 字数13千字2006年4月第一版2006年4月第二次印刷印数1-2000争峰书号:155066.2-16742 :n:; 定价8.00SN/T 1166.3-2006
