1、中华人民共和国出入境检验检菇行业标准SN/T 1632. 1-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分:分离与计数方法Detection of Enterobacter sakazakii from dehydrated powdered milk一Part 1: Isolation and enumeration 2005心8-18发布060608000101 龟，三、式;2006-0公01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检痊总局SN/T 1632. 1-2005 前宫SN/T 1632(奶粉中阪崎肠杆菌检验方法分为三个部分:一一第1部分:分离与计数方法:一一第2部分:PCR检验方法
2、;一一第3部分z荧光PCR检验方法。本部分为SN/T1632的第1部分，是参考美国FDABAM婴儿配方奶粉中阪崎肠杆酶的分离计数方法CIsolationand Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant For mula)方法形成。本部分的附录A和甜录B为规范性附录。e本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中黯检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人:罗茂凰、高旗利、张海英、张海滨、张霞、赵贵明、姚霞、顾鸣。
3、I 1 范围奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分:分离与计数方法SN/T 1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌的分离与计数方法。本部分适用于奶粉中阪崎踢杆菌的分离与计数，其他食品可参照执行。2 设备和材料2. 1 水浴箱:保持水温45.50C士0.20C。2.2 温度计z量程lOC550C，分刻度O.lOC。2.3 培养箱:350C370C和240C260Co2.4 吸管:1mL、5mL和10mL，分刻度0.1mLo 2.5 L型玻璃涂布棒:径3mm4 mm，可涂布45mm55 mm的区域。2.6 接种环;3mm直径二2. 7 天平=量程2比，感量0.1go 2.8 灭菌样品处理器具z取样勺、剪
4、刀、开罐器。2.9 样品稀释瓶:100mL、125mL、160mL、250mL和2，L样品稀释瓶。2.10 15 mmX150 mm灭菌平腿。2. 11 阪崎肠杆菌质控黯株:ATCC295440 2.12 API20E生化鉴定试剂盒或类似产品。2.13 VITEK生化鉴定系统或类似设备。3 培养基和试剂3. 1 膜化大豆蛋白琼脂(TSA)(见第A.1章)。3.2 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)(见第A.2擎)0 3.3 肠杆菌增商肉汤(EE肉汤)(见第A.3章)。3.4 显色培养基琼脂(Xa-GlcA)(见第A.4章)。3.5 氧化酶试验试剂(见附录第A.5章)。4 阪蜻肠杆菌检验方
5、法4. 1 方法提耍SN/T 1632.1 2005 奶粉中阪崎肠杆酶的分离与计数方法是应用微生物检验的增菌培养、分离、生化鉴定等方法对奶粉中可能存在的阪崎肠杆黯进行定性和定量的检验。4.2 检验程序阪崎肠杆菌的检验程序见图1。1 SN/T 1632. 1-2005 样品100gX3, 10 gX3, 1 gX3加入9倍蠢的5t菌蒸wi水或祥品100g 加入900mL5巨富蒸缩水36C士1CI 18 h-22 h 10 mL加入90mL炀杆茵增菌肉汤(EE肉汤)18 h-22 h 或结晶紫中性红Il!主主葡萄糖琼mr(VRBGA)平板36C士1CI 18 h-22 h 36C士1CI 18且-
6、22h 族化大豆蛋白琼扇门SA)平板显色培养基(X-GlcA)平板25C土1CI 48 h-72 h 36C士1c I 18 h-22 h 主在兰民染色氧化黯试验API20克生化鉴定试剂盒、VI1EK生化鉴定系统或其他图1阪崎肠杆菌的检验程序4.3 阪崎肠杆菌定量检验(MPN法)4.3. 1 定量检验是应用三管增茵法，检验和定量样品中极少量的阪崎蹄杆菌。检验需要333g 样品。4.3.2 取样前消毒样品包装的开启处和取样勺、无菌称取样品100g、10g和1g各三份分别加入2L、250mL和125mL的样品稀释瓶中，加入9倍预热到450C的灭菌蒸馆水(1: 10稀释)，或者将样品直接称最到装有9
7、倍预热到450C的灭菌蒸铺水的样品稀释瓶中，振摇使样品充分混匀，360C土lOC培养18h22 h。4.3.3 分别移取培养18h22 h的悬液各10mL加入90mLEE肉汤中，360C士lOC培养18h22 ho 4.3.4 轻轻混匀增菌蔽，用下列方法进行平板接种z直接涂布法:每份增菌液取0.2mL加到2个VRBGA平板或2个Xa-GlcA平板，每个平板0.1 mL，用无菌玻璃涂布棒涂布(如果预计奶粉中含有大量的细菌，应使用灭菌的EE肉汤将增菌液稀释10-4到10-6后涂布)。直接划线法z每份增菌液用3mm接种环(10L)分别接种2个VRBGA平板或2个X-GlcA平板，三区法或四区法划线，
8、以得到单个菌落。将平板置360C士lOC培养18h22 ho 4.3.5 观察平板上阪崎肠杆菌的典型形态:在VRBGA平板上z紫色菌落周围有一圈紫色的服汁酸沉淀环，因形，由起，直径2mm3 mm。在Xa-GlcA平板上z蓝绿色菌落，羁形，直径1mm2 mmo 4.3.6 从VRBGA平板上挑取5个可疑菌落分别接种到5个TSA平板，250C士lOC培养48h72 ho 4.3.7 从Xa-GlcA平板上挑取5个可疑菌落，革兰民染色，做氧化酶试验。革兰民染色阴性，氧化酶试验阴性，应用API20 E生化鉴定试剂盒或VITEK生化鉴定系统进行生化鉴定。4.3.8 从TSA平板上挑取黄色菌落，革兰民染色
9、，做氧化酶试验。革主氏染色阴性，氧化酶试验拥性，应用API20E生化鉴定试剂盒、VITEK生化鉴定系统或其他细菌鉴定系统进行鉴定。SNjT 1632. 1-2005 4.3.9 肠杆菌属细菌生化特性见表10表1脑杆菌属细菌生化特性生化特性a试验阪崎炀杆菌阴沟厨杆菌产气肠杆离聚囡肠抨茵葛离菲肠杆菌立sakazakii E. claacae E. aeragenes E. agglamerans E. gergaviae 赖氨酸胧竣酶十十精氨酸双水解酶十十鸟氨酸脱竣酶十十十十KCN生长十十十v 照糖十十十(十+ 卫矛自享(一)(一)核糖薛(一)十发棉子糖十十十十v 酵D-山梨董事十十v x-甲基-
10、D-葡萄糖营十(十D-阿拉伯糖一十十黄色素十十a 十:90%100%阳性;(十):75% 89%阳性;v:25%74%阳性;(一):10%24%归性;一:0%9%阳性。4.3. 10 计算MPN值，根据每一稀释度检出的眼崎勤杆菌的结果查MPN表(见附录盼，计算并报告每100g样品中的阪畸肠杆菌的最近似值。4.4 阪崎肠杆商定性检验检验样品中是否有嵌崎肠杆菌，检验需要100g样品。4.4. 1 取样前消毒样品包装的开启处和取样勺。无菌称取样品100g至2L的样品稀释瓶中，加入900 mL预热到450C的灭菌蒸锢水，或者将样品直接称量到装有9倍预热到450C的灭商蒸馆水的样品稀释瓶中，振摇使样品充
11、分混匀，360C士lOC培养18h22 ho 4.4.2 移取培养18h22 h的悬蔽10mL加入90mL EE肉汤中，360C金lOC培养18h22 ho 4.4.3 操作罔5.3. 35. 3. 80 4.4.4 根据检验结果，报告每100g样品中是否检出阪畸肠杆菌。3 SN/T 1632. 1-2005 A.1 模化大豆豆蛋白琼脂(TSA)A. 1. 1 成分膜蛋白陈植物蛋白氧化铀琼脂蒸锚水A. 1.2 哥哥法附录A(规范性附录)培葬基和试1I1J15 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 1000.0 mL 将各成分加入蒸铺水中，加热并不断搅拌，煮沸1min，使琼脂溶解，分装适当的
12、容器，1210C高压灭菌15min，最终pH7.3士0.20A.2 结黯紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)A.2.1 成分酵母抽取物3.0 g 蛋白陈7.0 g 氧化锵5.0 g 3号胆盐1. 5g 乳糖10.0 g 中性红0.03 g 结晶紫0.002 g 蒸铺水1000.0 mL A.2.2 哥哥法将各成分加入蒸馆水中(染料配成1%的水溶液过滤后加入)，如热煮沸，使各成分完全溶解，调节pH至7.4土0.10冷却至450C倾注直径150mm灭菌平血，可放置20C80C冷藏柜保存，4周内使用。A.3 肠杆菌增菌肉汤(EE肉汤)A. 3.1 成分蛋白陈葡葡糖磷酸氨工铀磷酸二氢饵牛胆盐煌绿蒸铺水
13、A.3.2 制法10.0 g 5.0 g 8.0 g 2.0 g 20.0 g 0.015 g 1 000.0 mL 必须使用纯净的牛肥盐和煌绿，减少对受损伤且数量极少的肠杆菌的生长抑制。将各成分加入蒸铺水中，加热煮沸，分装每瓶90mLo制成的培养基为绿色，可放置20C80C冷藏柜保存，4周内使用。A.4 显色培养基琼脂(X伽GlcA)A. 4.1 成分蛋白陈牛肉膏氧化铀琼脂月桂基硫酸铀5-澳4-氯3呵!跺-D葡萄糖背蒸铺水A.4.2 制法20.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 0.25 g 0.08 g 1000.0 mL SN/T 1632. 1一2005将各成分加入蒸馆水中，
14、加热搭解，调节pH至7.3土0.1.分装适当容器.12l.C高压灭菌3min. A.5 氧化酶试验试剂A. 5.1 成分四甲基对苯二胶蒸锢水A.5.2倍tl法1. 0g 100.0 mL 将西甲基对苯二胶溶于蒸馆水即可。使用新鲜配制的试剂，如放置于冷藏柜，可在配制后7d内使用。5 SN/T 1632. 1-2005 捕录B(规范性附录)眼蜻肠杆黯最可能数CMPN)检索表表B.1接种量分别为10.0g，1.0g和O.1 g时二三管法的MPN表及95%可信眩间阳性管数可信限阳性管数可信限MPN/100 g MPN/100 g 10.0 1. 0 0.1 低高10.0 1. 0 0.1 低高。110
15、0 420 注:如果接种量扩大十倍，分别为100.0g、10.0g和1.0g时，表中的数字相应缩小十倍。如果接种量缩小十倍，分别为1.Og、0.1g和0.01g时，表中的数字相应扩大十倍。6 山OONiF.SEHZ的中华人民共和离出入境检验检疫行业标准奶粉中阪蜻肠杆菌检验方法第1部分:分离与计数方法SN/T 1632.1-2005 * 中留标准出版社出版发行北京复兴门外旦旦河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦垒岛印刷广印刷* 印张o.75 字数12千字2005年11月第一次印刷开本880X1230 1/16 2005年11月第一版定价8.00元如有印装若错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533* 书号:155066 2-16475
