1、中华人民共和国出入境检验检度行业标准SN/T 1632. 3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分:荧光PCR方法Detection of Enterobacter sakazkii from dehydrated powdered milk Part 3: Real-time PCR method 2005-08-18发布060608000099 2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局嗯原因气-剧吕SN/T 1632(奶粉中阪崎肠杆菌检验方法分为三个部分:一一第1部分:分离与计数方法;一一第2部分:PCR方法;一一第3部分:荧光PCR方法。本部分为SN/T1
2、632的第3部分。本部分的附录A、附录B为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SNjT 1632.3-2005 本部分起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司。本部分起草人:吕敬章、赵贵明、谢丽琪、郑卫平、林镜中、肖性龙。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 1 范围奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分:荧光PCR方法SN/T 1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌的荧光PCR检验方法。本部分适用于奶粉中阪崎肠杆商的快速检验，其他食品可参照执行。2 规范性引用文件SN/T 1632.3 2005 下列文件中的条款通
3、过SN/T1632本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。SN/T 1632 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分:分离与计数方法3 定义、术语和缩略i吾下列术语、定义和缩略语适用于SN/丁1632的本部分。3. 1 阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii 肠杆菌科肠杆菌肩革兰氏阴性无芽抱杆菌，周身鞭毛有动力，大多数产黄色素，具有r葡萄糖昔酶活性。3.2 聚合酶链式反应polymerase
4、chain reaction 聚合酶链式反应，简称PCRo使用两段(20个24个核背酸)寡核背酸作为反应的引物，这两段寡核背酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可以和称为模板的待测DNA两条链上的位点分别发生互补。反应被由包括含有镜离子的反应缓冲液、4种单核昔酸(dNTP)、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下.通过温度的变化(DNA变性、退火及延伸)而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片段得以扩增。经30左右个循环，扩增倍数达10603.3 缩路语3. 3. 1 PCR: polymerase chain reaction，简称PCR。3.3.2
5、 DNA:deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。3. 3.3 dNTP: deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核昔酸二磷酸。3. 3. 4 dA TP: deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺昔三磷酸。3. 3. 5 dCTP: deoxycytidine triphospha忧，脱氧胞昔三磷酸。3.3.6 dGTP: deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟昔三磷酸。3. 3. 7 dTTP: deoxythymidine triphosphate，脱氧胸昔三磷酸。3.3.8 dUTP: deo
6、xyuridine triphosphate，脱氧鸟背三磷酸。3. 3. 9 UNG: uracil N-glycosylase，尿暗脆N-糖基化酶。3.3.10 Tris:tris(hydroxymethyl) aminomethane，三(是甲基)氨基Ifl烧。3.3. 11 Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的闰值时所经历的循环数。SN/T 1632.3-2005 4 测定方法4. 1 方法提要在普通PCR基础上，加入一条特异的寡核背酸荧光探针。该探针5端标记了FAM荧光素，3端标记TAMRA荧光素，此时FAM的荧光被TAMRA摔灭，仪器检验不到其荧光信号;PCR延伸阶段，Taq D
7、NA聚合酶发挥其53外切核酸酶功能，将探针切割，与此同时标记在探针上的FAM游离出来，其所发出的荧光不再为TAMRA所碎灭而被仪器检验到。PCR过程中，对目的片断进行一次有效的扩增，同时对探针进行了一次切割以及对FAM进行了一次检验。仪器检验到的FAM的增量，可以间接地反映目的片段的扩增量。奶粉经增菌后，取增菌液1rnL加到1.5 mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽蠢吸弃上清液;110入50LDNA提取液(使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取)，混匀后沸水浴5min , 12 000 r/rnin离心5min.取上清液作为模板进行荧光PCR扩增，观察荧光PCR仪的实时曲线，对奶
8、粉中的阪崎肠杆菌进行快速检验。4.2 试剂和材料见SN/丁1632.1。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。4.2. 1 引物5-CCGTTCGACGTAGCACTGC也35-CAT AGAATTCACGACGACGAACT、TC-34.2.2 探针FAM皿5rCAAACGTTCCTGCGAGAAAGCG(头3-TAMRA4.2.3 Taq DNA聚合酶。4.2.4 dNTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP。4.2.5 DNA提取试剂:0.1%Chelex100水榕液。4.2.6 10XPCR缓冲液:200rnmol/L Tris-HCl(pH8.的，200rnrno
9、l/L氧化饵，15rnrnol/L氧化镜。4. 3 仪器和设备见SN/丁1632.1，4.3. 1 荧光PCR仪。4.3.2 离心机:20 000 r / rnin , 4.3.3 移液器:10L、100L、200L、1000L。4. 3. 4 水浴锅。4.4 步骤4.4. 1 阪崎肠杆菌定量检验(MPN法)定量检验是基于二三管增菌法，以定量检验样品中极少量的微生物。试验至少需要333g样品。4.4.2 取样和增葡取样前消毒样品包装的开启处和取样工具。按照三管增菌法，无菌称取样品100g、10g和1g 各三份分别加入2L、250mL和125mL的样品稀释瓶中，加入9倍预热到45C的灭菌水(1:
10、 10稀释)，或者将样品直接称童到装有9倍预热到45C的灾菌水的样品稀释瓶中.振摇使样品充分说匀-36C士1C培养18h22 h。分别移取培养18h22 h的悬液各10mL加入90mL肠杆菌增菌肉汤(EE肉汤)中，36C土1C培养18h22 h。4.4.3 模板DNA准备每瓶培养的EE肉汤分别取1mL加到1.5 rnL元菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清液;加入50LDNA提取液(使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取)，混匀后沸水浴5min , SN/T 1632.3一200512 000 r/min离心5min，取上;青?夜以待检验(如不能及时检验，可将上清攘于一20C保
11、存)。4.4.4 荧光PCR检验反应体系总体积为25L，其中含:10 X PCR缓冲液2.5L、引物对00mol!L)各1L、dNTP(10 mmol/U 1L、TaqDNA聚合酶(5U/U 0.5L、水17L、模板DNA2L，反应步骤:37C 5 rnin，95C预变性3min，反应步骤二:95C变性55，60C退火延伸405，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。反应产物可在4C保存。检验过程中分别设阳性对照、阴性对照。以含有扩增片断的质粒为阳性对照，以灭菌水作为阴性对照。5 结果及判断检验样本c，值小于或等于35.0时.报告阪崎肠杆菌筛选陌性:检验样本c，值大于35.0且小于40.0时，
12、重复一次，如果C，值仍小于40.0.且曲线有明显的对数增长期.可报告阪崎肠杆菌筛选阳性.否则报告阪崎肠杆菌未检出;样本检验不至iJC，值时.报告阪崎肠杆菌米检出。筛选阳性的样本，按SN/T 1632. 1-2005中5.2进行确证。阪崎肠杆菌的计数按SN/丁1632.1的规定进行。本部分的检验程序见附录A，6 废弃物处理和防止污染的措施检验过程中的J2t弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检验过程中防止交叉污染的措施见附录B。3 SN/T 1632.3-2005 附录A(规范性附录)荧光PCR检验方法程序样品100gX3, 10 gX3, l gX3各加入9倍的灭菌蒸tl!l水36C土1CI 18
13、 h-22 h 取10mL加入90mL肠杆菌增菌肉汤(巴E肉汤)36C士1CI 18 h-22 h 荧光PCR检测阴性图A.1程序图4 SN/T 1632.3一2005附录B(规范性附录)检验过程中防止交叉污染的措施B. 1 抽样和制样过程抽样和制样工具，必须清洗干净，1210C高压灭菌1臼5minr户、.乌、白用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。B. 2 检验过程B. 2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区和后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从净区到脏区单向进行。B.2.2
14、实验过程中，必须穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。B. 2. 3 各区所有的试剂、器材(尤其是移液器人仪器都应专用，不得带出该区。B. 2. 4 所有洛液、水、耗材和器具要1210C、15min高压，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液必须使用高质量的成分和新蒸锚的双蒸水。在200C250C贮存的试剂中，可加入0.025%的叠氮化纳。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。B.2.5 DNA模极或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气珞胶oB. 2. 6 前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反应各组分。B.
15、 2. 7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。B. 2. 8 可使用UNG酶和dU丁P系统控制污染。B. 2. 9 应遵循PCR操作的其他要求。D mOONi的.N的FH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分:荧光PCR方法SN/T 1632.3-2005 A 中标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045同址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷号哈印张O.75 字数102005年11月第一次印刷开本880X1230 1/16 2005年11月第一版- 定价8.00元如有即装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066.2-16477 SN/T 1632.3一2005
