1、ICS 11. 060. 10 C 33 中华人民共和国医疗行业标准YY/T 0127.10-2009 代替YYjT 0127. 10-2001 口腔医疗器械生物学评价第2单元:试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验CAmes试验)Biological evaluation of medical devices used in dentistry -Part 2: Test method-Salmonella typhimurium reverse mutation assay CAmes mutagenicity test) 2009-06-16发布2010-12-01实施国家食品药品监督管理
2、局发布VY/T 0127.10-2009 前口腔医疗器械生物学评价系列标准中的第1单元，YY/T0268一2008(牙科学口腔医疗器械生物学评价第1单元z评价与试验是口腔医疗器械生物学评价与试验项目的选择，为指南性标准。YY/T 0127(口腔材料生物学评价第2单元试验方法分为以下几部分z一-YY/T0127.1-1993 口腔材料生物试验方法溶血试验E一-YY/T0127.2一xxxx口腔医疗器械生物学评价第2单元z试验方法急性全身毒性试验z静脉途径s一-YY/T0127.3-1998 口腔材料生物学评价第2单元z口腔材料生物试验方法根管内应用试验F一-YY/T0127.4 1998 口腔材
3、料生物学评价第2单元z口腔材料生物试验方法骨埋植试验;一YY/T0127. 5二1999口腔材料生物学评价第2单元z口腔材料生物试验方法吸入毒性试验;一YY/T0127. 6 1998 口腔材料生物学评价第2单元z口腔材料生物试验方法显性致死试验;二-YY/T0127. 7一2001口腔材料生物学评价第2单元2口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用试验;一YY/T0127.8二2001口腔材料生物学评价第2单元z口腔材料生物试验方法皮下植入试验p一一-YY/T0127. 9一2001口腔材料生物学评价第2单元:口腔材料生物试验方法细胞毒性试验(琼脂覆盖法及分子掠过法); 一-YY/T0127.10
4、-2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元z试验方法鼠伤寒沙门民杆菌回复突变试验CAmes试验h一-YY/T0127.11一2001牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元z口腔材料生物试验方法盖髓试验F-YY/T 0127.12-2008牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元z试验方法微核试验;-YY/T 0127. 13-2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元z试验方法口腔甜膜剌激试验;-YY/T 0127.14二2009口腔医疗器械生物学评价第2单元z试验方法急性经口全身毒性试验F一一-YY/T0244 1996 口腔材料生物试验方法短期全身毒性试验z经口途径。本部分为YY/
5、T0127的第10部分。本部分代替YY/T0127. 10-2001。本部分与YY/T0127.10-2001相比，主要变化如下z-一标准名称改为:(日腔医疗器械生物学评价第2单元E试验方法鼠伤寒沙门民杆菌回复突变试验CAmes试验H;-一规范性引用文件做了相应修改;I YY/T 0127.10-2009 E 一一浸提液剂量由200mg/mL改为最高剂量z一一受试样品由五个剂量改为至少三个剂量。分为最高剂量组、1/2最高剂量组和1/4最高剂量组;一一增加对固化类材料样品制备要求对于固化类材料，考虑固化状态材料的诱变性时，建议采用固化24h士2h的试样进行试验。即试样固化后放于室温下，密封保存2
6、4h士2h。也可根据其使用特点选择何时进行试验，但在报告中应予以注明;一一由于多氯联苯在国内、国外已经不再使用，因此将多氯联苯改为苯巴比妥与3-甲基胆草或与-苯丙黄酣作为诱导剂。本部分的附录A为规范性附录。本部分由国家食品药品监督管理局提出。本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。本部分由国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心负责起草。本部分主要起草人z林红、李盛林、付嘉、王衣祥、郝鹏。本部分于2001年首次发布。于2009年第一次修订。本部分所代替标准的历次版本发布情况为z一一-YY 0127. 10-2001。VY/T 0127.10-2009 1 范围口腔医疗器械
7、生物学评价第2单元:试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验CAmes试验)YY/T 0127的本部分规定了口腔医疗器械鼠伤寒沙门民杆菌回复突变试验方法。本试验用于测定可引起沙门氏杆菌基因置换和/或移码突变的口腔材料所诱发的依赖于组氨酸(his一)的菌株产生不依赖于组氨酸(his+)的基因突变。为检测口腔医疗器械的诱变性试验之一。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过YY/T0127的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新
8、版本适用于本部分。GB 7919-1987 化妆品安全性评价程序和方法GB 15193.4-2003 鼠伤寒抄门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验GB/T 16886.12 医疗器械生物学评价第12部分=样品制备与参照样品(GB/T16886. 12-2005 ,IS0 10993. 12:2002 ,IDT) 3 仪器3. 1 实验室常用设备。3.2 洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，低温高速离心机，低温冰箱(-80C)或液氮罐等。4 培养基和试剂的制备培养基和试剂的制备见附录A。5 菌株准备、鉴定和贮藏5. 1 菌株采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门民菌共四株TA97、TA98、TA100、TA102
9、。5.2 菌株贮存菌株贮存在加有二甲基亚酬的(光谱纯)新鲜细菌培养液中，其体积比为0.09: 1，混合后分装于小试管或菌种管内，经干冰丙酣液(一75C)或液氮(-196C)速冻，在一80c冰箱或-196c液氮中长期贮存。5.3 增菌培养从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37c振荡(100次Imin)培养10h 12 h，活菌数应达109/mL(OD600=0.的。细菌培养液从37c取出后，应立即放入4C中备用。试验需用当天孵育好的新鲜细菌。1 VY/T 0127.10-2009 5.4 菌株鉴定5.4. 1 组氨酸需求(his-)试验凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨
10、酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。鉴定方法:在底层培养基平皿表面加入O.5 m mo1/L L-组氨酸0.1mL和O.5 m mo1/L D-生物素0.1 mLo用L棒铺开.对照平皿只加生物素不加组氨酸.用自金耳浸细菌培养液，在对照平皿和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上，经37-c孵育24h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生益主主主um.平皿上不应生长.鉴定方法2:用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。待干后，吸取阿环萦(8mg/mL)榕液与菌株划线处交叉划线，37.C孵育24h。对
11、四环素有抗性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长.5.4.6 自发回变数(his+)的测定在小试管中加入融化的顶层培养基2mL，分别加入待测菌株的菌液0.1mL，迅速在高速液体混合器上混匀，倾倒在已固化的底层培养基平皿上，使其均匀分布。待固化后，经37.C孵育48h，计数全部菌落数。一个菌株应做2-3个平皿，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值在一个恒定的范围。各试验菌株的自发回变数分别为:TA97(97180) ;TA980S- 60); TA100(75-200); TAI02(240-360) 0加过S-9的菌株，自发回变数稍有增加.YY/T 0127.10-200
12、9 5.4.7 对阳性突变剂的敏感性鉴定使用已知阳性对照剂，检查试验菌株的敏感性是否降低，其方法同7。6 代谢活化剂大鼠肝微粒体酶(S-9)的诱导和制备6. 1 大鼠肝微粒体酶(5-9)的诱导选用体重150g200 g的健康雄性S-D大白鼠或体重110g150 g的Wistar大鼠。将苯巴比妥与3-甲基胆惠或与日，荼黄酣溶于玉米油中。可用下述三种方法之一进行诱导:a) b) o .C4 .C高速离可活性，确定最适用量。如果是阴7 受试样品的制备和剂量选择7.1 试样制备可选用生理盐水、二甲基亚枫(DMSO)或其他溶剂(毒性剂量以下)，无论选用何种溶剂，均应元诱变性。将材料制备成溶液、混悬液或浸
13、提液。浸提液制备按GBjT16886. 12规定的方法进行。对于固化类材料，考虑材料在固化状态的诱变性时，建议采用固化后24h土2h的试样进行试验。即试样制备后放于室温下，密封保存24h士2儿也可根据其使用特点选择何时进行试验，但在报告中应予以注明。7.2 受试样品剂量选择预试验用菌株TAIOO进行预试验(操作程序应与正式试验一致)，以了解受试样品对细菌的毒性。3 YY/T 0127.10-2009 决定受试样品的最高剂量的标准是细胞毒性和溶解度。细胞毒性表现是z平皿中回复突变菌落数减少，背景菌苔变清晰，40倍显微镜下背景菌苔稀疏，体积增大等。毒性大的受试样品，选择有轻微毒性的剂量作为试验的最
14、高剂量。毒性小、榕解度高的受试样品，最高剂量溶液50mg/mL，混悬液100 mg/mLo对于无法制备成溶液或混悬液的材料，制备成浸提液。最高剂量浸提液浓度不低于400mg/mL。7.3 受试样品正式试验剂量分组每种受试样品至少设三个剂量组。分为最高剂量组、1/2最高剂量组和1/4最高剂量组。8 诱变试验方法一次试验最少设三个受试样品剂量组(见7.3)及阴性(溶媒)对照组和阳性对照组，代谢活化和非代谢活化两种测试过程应同时进行。试验结果在有背景菌苔存在情况下，计算每个平皿的回变菌落数，并需重复试验1-2次。8. 1 预培养法分别取0.1mL受试样品液、0.5mL S-9混合液(需代谢活化时加。
15、不需代谢活化时加0.5mL不含S-g的磷酸缓冲液)，0.1mL细菌培养液。将三者移入元菌小试管内混合，在37c振荡培养20min, 再加入2mL顶层培养基，混匀后倾倒在底层培养基平皿上，使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转，经37.C孵育48h观察结果。8.2 平植掺入法将含0.5m mol/L组氨酸生物素的顶层培养基2mL分装于小试管中，45c恒温水浴中保温，每管再依次加入0.1mL受试样品液、0.1mL细菌培养液和0.5mL S-9混合液需代谢活化时加。不需代谢活化时加0.5mL不含S-9的磷酸缓冲液)，混匀后倾倒在底层培养基平皿上并使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转，经37.C孵育48h观
16、察结果。9 结果评定记录试验组和对照组的每一平皿的回变菌落数，每个试验组的回变菌落数以平均值和标准差(x土SD)表示。受试样品的回变菌落数高于阴性对照回变菌落数的二倍以上，并有剂量-效应关系或某一个或某几个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性反应，则判为诱变阳性。4 YY/T 0127.10-2009 附录A(规范性附录培养基和试剂的制备A.1 顶层培养剂琼脂1. 2g 氯化铀1. 0g 蒸馆水200 mL 加热溶化后，加入0.5m mol/L组氨酸生物素榕液20mL. 121 .C 104 kPa 20 min高压灭菌。A.2 底层培养基琼脂7.5 g 蒸馆水465 mL 121 .C 1
17、04 kPa 20 min高压消毒后，趁热(80C)在其内依次加入50X(V-B)培养基E10 mL和40%葡萄糖溶液25mL，混匀，按每皿30mL倒平皿，冷凝固化后倒置于37.C培养箱中24h48 h. A.3 Vogel-Bonner(V-B)培养基E(50X)1. 0g 10 g 硫酸镖(MgS04.7H20) 拘橡酸(C6H807 H20) 磷酸氢二饵(K2HP04) 50 g 磷酸氢镀铀(NaNH4HP04.4H20) 17.5 g 加蒸馆水至100mL 先将后三种溶解后，再加入硫酸镜，待完全溶解后，分装于锥形瓶里，121.C 104 kPa 20 min高压消毒。A.4 40%葡萄
18、糖溶液称取40g葡萄糖，加人蒸锢水至100mL, 115 .C 69 kPa 20 min高压消毒。4.C保存。A.5 营养肉汤培养基牛肉膏2.5 g 膜陈(或混合蛋白陈)5.0 g 氯化铀2.5 g 磷酸氢二饵1. 0g 蒸锢水500 mL 加热溶解，调pH至7.4 ,121 c 104 kPa 20 min高压消毒。4.C保存。A.6 营养肉汤琼脂培养基琼脂粉10 g 肉汤培养基500 mL 加热溶化或，调PH至7.4，121C104kPa20min高压消毒后，倒斜面或平皿。用于菌株鉴定、细菌活力鉴定或常规试验用菌株保存。5 YY/T 0127.10-2009 A. 7 O. 5 m mo
19、I/L组氨酸生物素溶灌D-生物素(相对分子质量244.3)30.9 mg L组氨酸盐相对分子质量191.7) 24.0 mg 加蒸铺水至250 mL 121 c 104 kPa 20 min高压消毒。4C保存。A. 8 凶混合渡配制按每毫升&-9混合液计算，见表A.1。表A.1S严9混合液配制成分标准浓度大鼠肝S-940L O. 4 mol/L MgC12 + 1. 65 mol/L KCl盐溶液20L 0.2 mol/L 6-磷酸葡萄糖25L 0.2 mol/L辅酶E20L 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.的500L 元菌蒸馆水395L 注z上述各成分按比例混匀，置冰裕中待用.A.9
20、 MgCh-KCI盐溶液(1. 65 mol/L KCI + O. 4 mol/L MgCh) 氯化饵(KCl)氯化镜(MgClz.6HzO) 蒸锢水加至121 .C 104 kPa 20 min高压消毒。A.10 0.2 mOI/L辅酶n(NADP)溶班NADP(相对分子质量765.。蒸锢水无菌无菌条件下配制，分装于EP管中，-20c保存。A. 11 O. 2 mol/L 6-磺酸葡萄糖饵-6-P)溶渣61. 5 g 40.7 g 500 mL 459.24 mg 3mL G-6-P铀盐相对分子质量304.1) 182. 46 mg 蒸馆水(元菌)3 mL 无菌条件下配制，分装于EP管中，-
21、20c保存。A.12 0.2 moI/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)磷酸二氢铀(NaHzP04.2HzO)(31.2g/L)120mL 磷酸氢二锅(NazHP04 12HzO) (71. 6 g/L) 880 mL 121 c 104 kPa 20 min高压消毒。4C保存。A. 13 O. 15 mol/L氯化饵溶液高浓度100L 20L 25L 20L 500L 335L 精确称取氯化伺11.18 g，用蒸锢水稀释至1000mL, 121 c 104 kPa 30 min高压消毒，冷却后冰箱6 l1r/T 0127.10-2009 保存，用于5-9制备。A.14 氨莘青霉素溶擅(8mg/mL
22、) 称取三是氨青霉素80mg，加人0.02mol/L氢氧化铀榕液10mL。无菌配制，4c保存。A.15 0.1%结晶萦溶液称取结晶紫10mg，加10mL无菌水，4c保存。A.16 四环素溶班(8mg/mL) 称取四环素40mg，加人0.02mol/L盐酸溶液5mL，用于四环素抗性试验。元菌配制，4c保存。3;%:goN|2.hNFOH5 中华人民共和国医药行业标准口腔医疗器械生物学评价第2单元z试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验CAm四试验)YY/T 0127.10-2009 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数16千字2009年12月第一次印刷开本880X12301/ 16 2009年12月第一版。定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533 书号:155066 2-20057 YY/T 0127.10-2009
