1、GB 15999 1995 前 E二丁型病毒性肝炎（以下简称丁型肝炎）是由丁型肝炎病毒（HOV）引起的。HOV是一种缺陷的RNA病毒，HOV必须依赖乙型肝炎病毒（HBV）的辅助才能感染人体，并易导致重型肝炎、慢性肝炎及肝硬化。我国是HBV感染高发区，故HOV感染可累及威胁着许多HBV感染者，使其病情进一步加重。因而丁型肝炎的防治亦非常重要。为此制定适用于全国范围的丁型肝炎诊断标准及处理原则，对于丁型肝炎的防治工作有深远意义。本标准的附录A是标准的附录本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位2北京医科大学第一医院、北京地坛医院、北京佑安医院。本标准主要起草人：玉勤环、徐道振、林秀玉。本标
2、准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。I 08 中华人民共和国国家标准丁型病毒性肝炎诊断标准及处理原则1 范围Diagnostic criteria and principles or management or viral hepatitis D 本标准规定了丁型肝炎的诊断标准和处理原则。本标准适用于各级医疗卫生部门用于丁型肝炎的诊断及防治的依据。2引用标准GB 15999 1995 F列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB 15990-1
3、995 乙型病毒性肝炎诊断标准及处理原则3 定义3. 1 同时感染coinfection 二种病原体同时感染。3-2 重叠感染superinfection 在种病原体感染的基础上又感染另一病原体。此处指在HBV感染基础上又感染HOV。4 诊断原则须依据流行病学资料，临床症状体征和实验室检查来综合诊断。确诊则须依赖病人血清或肝组织HDV感染标记物的检测。必要时则须进行肝穿刺，对肝组织做病理组织学检查及免疫组化或分子杂交法做病原学检查。5诊断标准5. 1 流行病学资料I司乙肝参照GB15990 3. z. 1-la急性无黄瘟型肝炎之流行病学资料，或与丁型肝炎病人有密切接触史，HBsAg阳性者更应注
4、意。5. 2 症状体征5. 2. 1 H!)V /HBV同时感染大多数表现为急性自限性肝炎经过1症状体征和急性乙型肝炎相同参照GB15990中3.Z.1.1b）和3.2.1.lc）急性乙型肝炎诊断标准中的症状体征），如病人有血清ALT及胆红素双相升高，更应怀疑为同时感染。少数病人表现为急性重型肝炎参照GB15990中3.2.1.5a) I）、2）急性乙型重型肝炎之症状体征。5. 2. 2 HOV /HBV重叠感染原来为血清HBsAg阳性者包括HBsAg携带者及慢性乙型肝炎病人，病情突然活动，或进行性国家技术监督局1995-12-15批准1996-07-01实施I ll t) GB 15999
5、1995 发展为肝硬化者，慢活肝或重型肝炎均应注意重叠HOV感染之可能。5. 3肝功能检测同急性慢性或重型乙型肝炎之肝功能检测f参照GB15990中3.2.1.1d),3.2.1.3 b),3.2.1.4 cl和3.2. 1. 5 a）中3）急性、慢诠、重型乙型肝炎之肝功能检测。5. 4 HOV感染标记物检测5. 4. 1 血清丁型肝炎病毒抗原（HDAg）见附录A中A3，必要时亦可检测肝内HDAg05.4.2血和（或）肝内HDVRNAo5. 4. 3 血清丁型肝炎病毒抗体5. 4. 3. 1 抗HD!gM见附录A中Alo5. 4. 3. 2 抗HD见附录A中AZ。5. 5 HBV感染标记物检测
6、，参照GB15990附录Ao上述5项中，5.5中HB,Ag阳性，5.4项中一项或一项以上阳性及5.3中肝功能异常即可确诊为丁型肝炎，5.1和5.2作为参考。在5.4及5.5中，如临床及病原学诊断符合急性乙型肝炎，伴HOV感染标记物中一项或项以上阳性，可诊断为HDV/HBV同时感染；如临床及病原学诊断符合慢J性乙型肝炎病毒感染，伴HOV感染标记物中一项或一项以上阳性，则可诊断为HDV/HBV重叠感染（参照GB15990附录Al。6预防治疗原则6. 1 同乙型肝炎（参照GB15990中4及5章。6.2 对住院病人中之了型肝炎病人应进行隔离，以防止HOV在HBV阳性者中传播。4 l () GB 15
7、999 1995 附录A（标准的附录）HDV感染的特异性检测本标准要求用El,ISA法检测HOV感染标记物，要求使用卫生部批准的诊断试剂盒。A1 应用酶联免疫捕捉法检测抗日DlgMA 1. 1 原理根据抗原抗体问特异性结合的原理利用抗人免疫球蛋白lgM（最好用抗链）捕捉待测血清中的lgM，然后加入HDAg，使之与血清中抗HDlgM结合，然后利用酶标i己的抗HD!gG.既具有与HDAg相反应的特性又具有酶的催化放大活性。当加入相应底物后，酶使底物氧化，使无色底物变为有色，利用颜色深浅或OD值的高低来确定抗HD!gM的有无及含量。A 1. 2 材料A 1. 2. 1 聚苯乙烯塑料板，40孔或96孔
8、。A 1. 2. 2 叮变微量加样器：20L和IOOL各一支。A 1. 2. 3抗人lgM（链）鼠抗人lgM年链单克隆抗体或兔羊抗人lgM（链多克隆抗体。A 1. 2. 4 日DAg：用基因工程抗原粗提液。A 1. 2. 5抗HDlgM阴性和阳性对照血清。A1. 2. 6 HRP抗HDlgG0A 1. 2. 7 包被液，0. 5 mol/L pH9. 5 9. 6的碳酸盐缓冲液（碳酸纳15.9 g，碳酸氢锅29.3 g）加水到lOOOml,110稀释使用。A 1. 2. 8 洗液，o.01mol/L,pH7.2 7. 4 ,PBS T（内含0.85%氯化锅，0.05%Tween 20）。A 1
9、. 2. 9 稀释液，o.01mol/L,pH7.27.4,PBS，用于稀释血清和标记抗体。A1. 2.10 底物液用前新配制。邻苯二胶（0PD)4mg，加基质液10mL（磷酸盐18.4 g，拧核酸纳5.1 g 溶于1000 mL离子水中，pH5.0,4保存备用）。待用时溶化后加3%过氧化氢50L混合均匀后立即使用。A1.2.11 终止剂，2 mol/l,H2SO。A 1. 3 试验步骤A 1. 3. 1 用。.05 mol/L pH9. 59.6的磷酸盐缓冲液稀释抗人lgM（链单克隆抗体包被聚苯乙烯板，每孔100l,4 C过夜。A 1. 3. 2 用PBST j先三次，拍干。A 1. 3.
10、3 每孔各加入1oo L 1 : 1 000稀释后的待检血清和阴阳性对照血清（阴性对照3孔，阳性对照2孔），37(:,)h0 A 1. 3. 4 负压1了用PBST洗板三次，抽干。A 1. 3. 5 每孔加入50100L经适当稀释后的HDAg24个ELISA单位，放45，1人A 1. 3. 6 洗三次后，每孔加入50L HRP抗HD!gG抗体于含10%小牛血清的PBS中），4245c. 1 h 0 A 1. 3. 7 洗三次后，加50L新鲜配制的底物液，放室温暗处显色1530min，当阳性对照显黄色后，每孔加l入1滴（25l,)2 mol/l，硫酸终止反应。A 1. 4 结果判断A 1. 4.
11、 1 目洞l法：棕黄色，黄色为阳性，浅黄色可疑g元色阴性。A 1. 4. 2 比色法测定492nm的OD值，并按式（Allit算真SIN值，凡SIN大于等于2.1抒为阳性zI I I 反之则为阴性。A 1. 5意义GB 15999-1995 待检测样品的OD.,S/N= 阴性对！照OD酬的均值“( Al ) 抗HD!gM阳性表示急性期或近期HDV感染；HDV/HBV同时感染抗HDlgM多呈短暂阳性；如二者重叠感染则多呈持续阳性，如同时检测抗HBclgM及抗日BclgG亦可用之区别HDV/HBV同时感染或是重叠感染，故抗HD!gM检测具有重要诊断价值。A2酶联免疫吸附阻断法检测抗HD抗HD总抗体
12、其中主要是抗HDlgG。A2. 1 原理利用抗原抗体之间的特异性反应，测定待检血清中的抗体阻断酶标记抗HD与HDA之间特异性结合的能力A2. 2 材料A2. 2. 1 抗HDlgG多克隆或且在克隆抗体用于包被。A2. 2. 2 抗HDV阳性、阴性对照血清。A2. 2. 3 HDAg,HRP抗HD!gG，包被液，稀释液及洗液等均同上A2. 3试验步骤A2. 3. 1 用包被液稀释抗HD抗体至适当浓度后包被聚苯乙烯板，每孔100L，放37，lh,4过夜。A2. 3. 2 负压下洗板三次拍干，每孔加入HDAg50 L，放42，2h。A2. 3. 3 洗三次后每孔分别加入lI 10稀释的待检血清50L
13、和阴性、阳性对照血清（设3孔阴性对！照，2孔阳性对照），加入抗HD-HRP37，1 h. A2. 3. 4 洗三次后，每孔加50L新鲜配制的底物液放室温暗处显色1530min，当阴性对照显色后每孔加1滴2mol/L硫酸终止反应。A2. 4 结果判断目测法无色或淡黄色为抗HD阳性s棕黄色或黄色为抗HD阴性。比色法测定待测样品及阴性对照孔的OD剧，按式（A2）计算阻断率。阴性对照oo ., 样品oo.,阻断率（%） 100 .”( A2 ) 阴性对照OD础凡样品阻断率大于50%为阳性，反之为阴性。A2. 5意义抗HD阳性表明曾有过HDV感染，如高滴度亦可表示为现在感染。A3应用双抗体夹心酶联免疫吸
14、附法检测HDAg A3. 1 原理HD Ag外面被HBsAg包裹，用除污剂（Tween20或NP40）裂解后才被释放出来。利用抗原抗体结合的免疫学原理，用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测HDAg.A3. 2 材料A3. 2. 1 抗HDlgG纯化抗体，用于包被。A3. 2. 2 抗HBc单克隆抗体，ELISA滴度l: 10万，用于稀释HRP抗HD0A3. 2. 3 10% Tween 20。A3. 2. 4 HRP抗HD及其他材料同上A3. 3试验步骤112 GB 15999 1995 A3. 3. 1 用包被液稀释抗HDlgG，包被聚苯乙烯板，每孔100L,37，I h ,4过夜。A3. 3.
15、2 洗三次后，每孔分别加入待测血清及阴性阳性对照血清50L（阴性对照血清3孔，阳性对照2孔）和10%Tween 20 50 L，充分混匀后放室温过夜，使之裂解HDV表面包裹的HBsAg而释出HDAgo洗三次后，舟孔加入50l,HRP抗HD（稀释液中含10%小牛血清和10个ELISA单位的抗HBc单克隆抗体），放45，1h（或37，2h）。A3. 3. 3 洗三次后每孔加50L新鲜配制的底物液放室温暗处显色1530min后，每孔加25L 2 mol/L硫酸终止反应gA3. 4 结果目泪lj法：棕色或黄色为HDAg阳性；无色为阴性。比色法：测定样品及阴性对照的OD础，按式（A3）计算SIN值，SIN值大于等于2.I为阳性。样品。！），SIN陌芽煎）坷m. ( A3 ) A3. 5意义HD Ag可存在于受感染的肝细胞和血中，HDAg阳性示体内有HDV复制。A3. 6 注意李项A3. 6. 1 HOV与HBV感染同时存在，血标本经除污剂处理后，HDAg与HBcAg仍可能同时存在，故要注意防止HBcAg的干扰，因而酶标记物中必须加入特异性中和HBcAg的单克隆抗体以排除之。A3. 6. 2 因外周血中HDAg量少，故检测血清至少要用3050I，。A3. 6. 3 若阴性对照OD值为0，一般取0.05作为阴性对照值计算。I I : I
