1、ICS 65. 020. 30 B 44 G昌中华人民共和国国家标准GB/ T 14926.50,-.,14926. 55- 2001 实验动物微生物学检测方法(3)Laboratory animal- Microbiological examination methods 2001- 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB / T 14926. 5014926. 55-2001 . 目录GB/ T 14926.50一2001实验动物酶联免疫吸附试验GB/ T 14926.51- 2001 实验动物免疫酶试验.5 GB/ T 14926.
2、52- 2001 实验动物免疫荧光试验.GB/ T 14926. 53-2001 实验动物血凝试验.12 GB/ T 14926.54-2001 实验动物血凝抑制试验.GB/ T 14926.55- 2001 实验动物免疫酶组织化学法.GB/T 14926. 50- 2001 前本标准修订了GB/T14926.18-1994(实验动物联免疫吸附试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:贺争鸣。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法中的酶1 中华人民共和国国家标准实验动物酶联免疫吸附试验Laboratory an
3、imal-Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 1 范围本标准规定了酶联免疫吸附试验(ELISA)所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。2 原理GB/ T 14926.50-2001 包被于固相载体表面的己知抗原与待检血清中的特异性抗体结合形成免疫复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。3 主要试剂和器材3. 1 试剂3. 1. 1 抗原3. 1. 1. 1 特异性抗原将病毒接种其敏感细胞培
4、养增殖(表1)，当细胞病变达+时收获，冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成EL1SA抗原。3. 1. 1. 2 正常抗原未接种病毒的相应细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。3. 1. 2 酶结合物EL1SA法常用以下两类酶结合物。3. 1. 2. 1 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬或猴IgG抗体。用于检测相应动物血清抗体。3. 1. 2. 2 辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)。用于检测小鼠、豚鼠、兔、犬和猴血清抗体。3. 1. 3 对照血清3. 1. 3. 1 阳性血清用病毒抗原免疫清洁或SPF小鼠、大
5、鼠、豚鼠、地鼠或普通级兔、犬、猴所获得的抗血清;或自然感染恢复后的犬、猴血清。3. 1. 3. 2 阴性血清清洁或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或确认无相应病毒感染的兔、犬、猴血清。3.1 . 4 包被液(0.05mol/ L pH9. 6) 碳酸铀碳酸氢铀蒸锢水3.1.5 PBS(O. 01 mol/L pH7. 4) 1. 59 g 2.93 g 加至1000 mL 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-08 -29批准2 2002- 05-01实施GB/ T 14926.50一2001氯化铀氧化梆磷酸二氢饵磷酸氢二铀(NazHP04 12HzO) 蒸馆水3. 1. 6 洗涤
6、液PBS(O. 01 mol/ L pH7. 4) Tween-20 3.1.7稀释液含10%小牛血清的洗禄液。3. 1.8 磷酸盐-拧攘酸缓冲液(pH5.0)拧朦酸磷酸氢二铀(NazHP04 12H20) 蒸锢水3.1.9 底物溶液磷酸盐-拧棱酸缓冲液(pH5.0)邻苯二胶COPD)30%过氧化氢3. 1. 10 终止液(2mol!L硫酸)硫酸蒸馆水3. 2 器材3. 2.1 酶标仪。8 g 0.2 g 0. 2 g 2.83 g 加至1000 mL 1 000 mL 0. 5 mL 3.26 g 12.9 g 700 mL 10 mL 4 mg 2L 58 mL 442 mL 3. 2.2
7、 聚苯乙烯板:40孔、55孔或96孔(可拆或不可拆)，用前洗净晾干，在紫外线下20cm处照射1 h。3.2.3 微量加样器:容量550L、50200L。3. 2.4 3TC培养箱。4 操作步骤4. 1 包被抗原根据滴定的最适工作浓度，将特异性抗原和正常抗原分别用包被液稀释。每孔100L，置3TC1 h 后再4C过夜。4.2 用洗涤液洗5次，每次3mn，叩干。4.3 加样待检血清和阴性、阳性对照血清分别用稀释液做1: 40稀释，分别加入两孔(特异性抗原孔和正常抗原孔)，每孔100L，37C1 h，洗涤同上。4.4 加酶结合物用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度，每孔加入100L，3TC1h，洗搔同上
8、。4. 5 加底物溶液每孔加入新配制的底物溶液100L，置37C，避光显色1015min o 4.6 终止反应每孔加入终止液50L。4. 7测A值在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。3 GB/ T 14926. 50- 2001 5 结果判定在阴性和阳性对照血清成立的条件下，进行结果判定。5. 1 同时符合下列3个条件者，判为阳性。5. 1. 1 待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别;5. 1. 2 待检血清与特异性抗原反应的A值二三0.2;5.1.3 待检血清与特异性抗原反应的A值/阴性对照血清与特异性抗原反应的A值二三2.105. 2 均不符合上述3个条件者，判为阴性。5
9、. 3 仅有1-2条符合者，判为可疑。需选用同一种方法或另一种方法重试。表1ELISA抗原的制备病毒细胞、鸡胚收获时间，d细胞病变HV E6 10- 14 LCMV Vero 7-10 +十十十+Ect. BHK21 , Vero 2- 3 +-+ MHV DBT ,L929 2-4 +十十-+Sendai 鸡胚3 +-+ Reo3 BSC- l ,BHK21 4-5 + PVM BHK21 10-14 +-+ TMEV BHK21 5- 6 +十+MVM ME ,3T3 7-10 + MAd MK ,ME,3T3 3- 5 + Polyoma ME ,3T 3 10-14 +十-+KRV R
10、E 7- 12 +-+十十H- l RE 7- 12 +-+十RCV/ SDAV DBT ,L929 2-3 +-+十+RRV MA-104 2- 3 +-+十+RV BHK21 6-7 +十十-+CPV FK81 3-5 +-+ ICHV MDCK 3- 4 +- + CDV Vero 8- 10 +- + B Virus Vero 1-2 +十-+SRV Raji 10- 14 细胞融合SIV CM-174 10- 14 细胞融合SPV BHK21 2- 3 +十-+注:MK-小鼠肾细胞;ME-小鼠胚细胞;RE-大鼠胚细胞.4 CCAVl-川HKu。F飞F、(CMHu。F飞hgu华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(3)GB/ T 14926. 5014926. 55- 2001 国中9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售* 开本880X12301/16印张1地字数39千字2002年2月第一版2002年2月第一次印刷印数1-2000 7G 定价13.00网址书号:1550 66 1- 18098 9峰595-549 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533科目GB/ T 14926.50-2001 H
