1、GB/T 16344 1996 前咖啡因(caffene)又名咖啡碱，属甲基黄瞟岭化合物，化学名称为1，3，7一三甲基黄瞟岭，具有提神醒脑等剌激中枢神经作用，但易上痛。为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准。美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200mg/L，南斯拉夫规定不得超过120mg凡，到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过150mg/吨，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡肉的标准测定方法十分必要。紫外分光光度法和高效;夜相色谱法(HPLC)是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡国含量的削定方法。其方法简单、快速、准确。最假检出浓
2、度:紫外法对可乐型饮料为3mg/L;对咖啡、茶叶及其固体制品为5mg/l00 g;对咖啡和茶叶的被体制品为5mg/LoHPLC法对可乐型饮料为0.72mg/L; 对茶叶、嘟啡及其制品为1.8 mg/l00 go 本标准的甜录A为提示的附录。本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准起草单位:上海市食品卫生监督检验所、上海卫生检疫局。牛二标准主要起草人:第一篇为何倩琼、郑理、方有宗、李绍良;第二篇为李绍良、庄慎谦、毛屉林、何的琼。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。中华人民共和国国家标准GB/T 16344-1996 饮料中咖啡因的测定方法Method for determ
3、ination of caffeine in beverages 1 菇围本标准规定了可乐理饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含最的测定方法一-紫外分光光谱法和高效液相色谱法(HPLC)。本标准适用于可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的栅定。第一篇紫外分光光谱法2 原理咖啡因的三氯甲烧溶液在276.5nm波长下有最大吸收，其暖收锚的大小与咖啡因浓度成正阳，从而可进行定量。3试$1本标准所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为燕锢水。3.1 无水硫酸纳。3.2 三氯甲烧z使用前重新蒸铺。3.3 1. 5 %(m/V)高镜酸饵潜被:称取1.5g菌锺酸饵，用水榕解并稀释重100mL。3. 4 亚硫酸
4、铀和硫氨酸饵掘合溶被z称取10g无水亚硫酸纳(NaZS03)，用7.l溶解并稀释至100mL。另敢10g硫霞酸饵，用水搭解并稀释至100mL，然后工者均匀海舍。3.5 15% (V /V)磷酸搭液z吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀释至到度，棍匀。3. 6 20% (m/V)氢氧化铀溶液s称取20g氧氧化锅，用水榕解，冷却后稀释至100mL。3. 7 20 % (m/V)乙酸悻潜液z称取20g乙酸钵Zn(CH3COO)z 2HzO，加入3mL冰L酸，用水溶解并稀释至100mLo 3. 8 10%(m/V)亚铁氧化梆榕液z称取10g亚铁氧化饵K4Fe(CN)6.3HzO用水溶解并稀释
5、至100 mLo 3.9 咖啡因标准品s含量98.0%以上。3.10 咖啡匮标准锚备液s根据蝴啡困标准品的含量用重蒸三氯甲烧配制成每毫升相当于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。4 仪器紫外分光光度计。中华人民共和国卫生部1996-06-19批准1996-09-01实施GB/T 16344 -1996 5 分析步骤5.1 样品的处理5. 1. 1 可乐型饮料:在250mL的分班漏斗中，准确移入10.020. 0 mL经超声脱气后的均匀可乐型饮料试祥，加入1.5%高锤酸何溶被5mL，摇匀，静置5min，加入混合榕液10mL，摇匀，加入15%磷酸溶液1mL，摇匀，加入20%氢氧化纳溶液1mL，
6、摇匀，加入50mL重蒸三氯甲烧，振摇100次，静止分层，收集三氯甲皖。JJ主再加入40mL重蒸三氯甲烧，振摇100次，静置分层。合并二次三氯甲烧萃取液.并用重蒸三氯甲:民定容至100mL，摇匀，备用。5. 1. 2 咖啡、茶叶及其固体制成品:在100mL烧杯中称取经粉碎成低于刮目的均匀样品O.5 2.0 g，加入80mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h，然后将浸出液全部移入100mL容量瓶中，加入20%乙酸抨溶液2mL，加入10%亚铁氧化饵溶液2mL，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过撑。取滤液5. 020. 0 mL按5.1. 1操作进行，制备成100mL三氯甲:境溶液，备用。5. 1
7、. 3 咖啡或茶叶的液体制成品:在100mL容量瓶中准确移入10.020. 0 mL均匀祥品，加入20%乙酸铸溶液2mL，摇匀，加入10%亚铁霞化挥溶被2mL，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静贵沉淀，过滤。取滤液5.020. 0 mL按5.1. 1操作进行，制备成100mL三氯甲皖榕被，备用。5.2 标准曲线的绘制从0.5mg/mL的咖啡因标准储备破中，用重蒸三氯甲烧配制成放度分别为0，5，10，15，20g/mL的标准系列，以0问/mL作参比管，调节零点，用1cm比色杯于276.5nm下削量吸光度，作吸光度咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。5.3 样品的测定在25mL具塞试管中，加
8、入5g无水硫酸纳，但j入20mL样品的三氯甲烧制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲:皖用1cm比5杯于276.5nm测出其吸光度，根据标准曲线(或直线回归方程)求出样品的吸光度相当于啪啡囚的浓度c(问/mL)，问时用重蒸三氯甲皖作试剂空白。6 结果6.1 计算:(c-(0) X 10O. .1 000 可乐型饮料中咖啡因含量(mg/L)二，二二二二二:二二二二二二;二二二二二二;二二二二二二;二二二二二;二二二二;二二二二;二二:二:(C一co)X 100X 100X 100 咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量(mg/100g)= ,-;、，、.,. ( 2 ) 咖啡或茶叶的液体制成品中咖啡国
9、含量(mg/L)式中:(一一样品吸1t度相当于咖啡因浓度，g/mL;(c-co) X 100 X 100 X 1 000 V1 XVXl 000 co 试剂空白吸光度相当于咖啡因放度，问/mL;m一一称取样品的成量，g;V一移取样品的体积，mL;V1 -移取样品处理后水榕液的体积，mL。6.2 在本实验条件下:( 3 ) 本法仪器检出限为0.2g/mL，方法检出限可乐型饮料为3mg/仁，咖啡、茶叶及其固体制成品为5 mg/100g，咖啡或茶叶的液体制品为5mg/L。标准曲线线性范围:0.030. 0吨/mL。幸自关系数:0.999。方法西归率:90.1%101.8%。相对标准偏差:小于4.0%
10、。6.3 允许差:GB/T 16344 1996 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料为10%.咖啡、茶叶及其制品为15%。第二篇高效液相色谱法(HPLC)7 原理啪啡因的甲醇破在286nrn波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡园散度成正比，从而可进行走量。8试荆8. 1 甲醇:HPLC试剂。8.2 乙睛:H凹_C试剂。8. 3 气氯甲皖:分析纯(必要时须重燕)。8.4 超纯水(18.2Mmo 8.5 元水疏酸纳2分析纯。8.6 氧化制:分析纯。8. 7 咖啡同标准品:纯度98%以上。9 仪器和设备9.1 液相色谱。9.2 色谱柱Bondapak C18(30 crnX
11、 3.9 rnrn id)。9.3 预柱RESAVE C180 9.4 超声清洗器(CQ25的。9.5 泪纤微孔滤膜。10 分析步骤10. 1 样品的处理10. 1. 1 可乐型饮料10. 1. 1. 1 脱气:样品用超声清洗器在40C下超声5rnino 10. 1. 1. 2 过滤z取脱气试样10.0rnL通过泪纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5rnL.保留后5rnL备用10. 1. 2 咖啡、茶叶及其制成品称取2g已经粉碎且小于30目的均匀样晶或液体样品放入150rnL烧杯中，先加23rnL超纯水，再加50rnL三氯甲饶，摇匀，在超声处理机上萃取1rnin(30 s二次).静置30rnin.分层
12、。将萃取液倾入另一150rnL烧杯。在样品中再加50rnL三氯甲饶，重复上述萃取操作步骤，弃去样品，合并二次萃取液，加入少许先水硫酸锵和5rnL饱和氧化纳，过滤，掠入100rnL容量瓶中，用兰氯甲烧定容至100 rnL。最后取10rnL滤被按10.1.1.2操作进行。10.2 色谱条件10.2.1 流动相:甲醇=乙腊2水皿57: 29 : 14(每升斑动柜中捕入O.8 rnol/L z.酸被50mL)。10.2.2 流动柜的流速:1.5 rnL/min o 10.2.3 进样z可乐型饮料10L，茶叶、咖啡及真制成品520LoGB/T 16344-1996 10.3 标准曲线的绘制府甲醇配制成咖
13、啡国浓度分别为0，20，50，100，150问/mL的标准系列，然后分别进样10L于坡长为286nm处测量峰面积，作峰顶积咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。10.4 样品测定从试样中吸取可朱饮料10L或咖啡、茶叶及其制品5mL进样，于286nm处测其峰韶积，然后根据标准曲线(或直线回归方程)得出样品的峰面和相当于咖啡因的浓度c(阅/mL)。同时作试剂空白。11 结果11. 1 计算:可乐型饮料中咖啡因含量(mg/L)口c. . . . . . . . (4) 10c 咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量(mg/100g)二F. (5) 式中:F一一进样量是5L的倍数。11.2 在本实验条件下
14、:本法仪器检出限为0.72问/mL，方法检出限:可乐型饮料为0.72mg/L，咖啡、茶叶及其制品为1. 8 mg/100 go 标准曲线线性范围:0.0150. 0月/mL。相关系数:0.9990方法回收率:91.9%105. 8%。相对标准偏差:小于2%。11. 3 允许差:同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮科为5%，嘟啡、茶叶及其制品为10%。GB/T 163441996 附录A(提示的附录饮料中咖啡阔的测定方法A1 方法研制及验证结果方法研制及验证结果见表Al及表A20表Al紫外分光光谱法研制及验证结果研制单位验证单位单位上海市食品卫生上海长宁区监督检验所上海卫生检
15、疫局卫生防疫站广东省食品卫生监督检验所祥品名称可乐型即溶咖啡可乐型即溶咖啡茶叶可乐裂即溶咖啡可乐裂即溶咖啡饮料饮料饮料饮料样品件数，件3 1 1 I l I 1 1 l 测定次数10 10 5 5 10 5 f 广5 5 次/件0.262 7 标准差S 4.118 7 1. 741 12.382 1. 12 59.2 3.231 10.228 0.527 5 0.39 相对标准 3.67 1. 64 0.49 1. 85 1. 92 3.16 0.39 羞CV，%2. 55 95. 6 90.1 95.0 98.5 95. 8 96.8 94.6 94.4 回收来，% 101. 8 99.9
16、97.9 100.1 104.2 103.4 97.89 98.08 标准曲线O. 999 20. 999 9 O. 999 70. 999 9 O. 999 60. 999 9(n=5) o. 998 60. 999 8(n=5) 相关系数(n=10) (n=5) 表A2高效液相色谱法研制及验证结果研制单位验1iE 单位单位上海卫生检疫局上海市食品卫生监督检验所上海长宁区卫生防疫站样品名称可乐型饮料咖啡新茶可乐型饮料天然咖啡茶叶可乐饮料即溶咖啡样品件数，ft2 1 3 1 l 测定次数次/件5 5 5 5 10 5 5 5 GB/T 16344-1996 表A2(完)研制单位验证单位单位上海
17、卫生检疫局上海市食品卫生监督检验所上海长宁区卫生防疫站样品名称可乐型饮料咖啡新茶可乐型饮料天然咖啡茶叶可乐饮料即溶咖啡l0.331 7 标准差S 28.30 22.34 119.11 46.60 1. 33 70.14 1. 332 3 格对标准差cv% 0.49 。.730.85 3.19 1. 71 1. 22 1. 52 1. 36 91. 91 94.34 96.0 93.2 93.8 95.7 96. 7 回收率，% 104.25 105.75 105.9 98.3 99.6 105.7 104.4 标准曲线相O. 999 70. 999 9(n=5) 0.9996-0.9998(n=5) O. 999 10. 999 9(n口5)关系数A2 方法评价紫外分光光谱法和高效被相色谱法，方法简单，快速稳定、准确、灵敏度高、干扰物排除能力强，适用于各层次实验室对饮料中咖啡国含量的测定。
