1、ICS 65.020.01 B 21 噩噩中华人民共和国国家标准G/T 19563一2004大豆种子品种鉴定实验方法简单重复序列间区法Experimental identification method for variety of soybean seed-ISSR 2004-06-22发布2004皿12-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也士中国国家标准化管理委员会战叩G/T 19563-2004 前本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准起草单位:国家农业标准化监测与研究中心(黑龙江)、黑龙江省质量技术监督局。本标准主要起草人z王庆贵、徐晶、姜
2、雯、李光宇、石绍业、郝兆军。I G/T 19563-2004 引吉同目前，我国农作物种子的鉴定多采用种植鉴定、快速测定法(苯酣染色法、大豆种皮愈创术酣染色法、高粱种子氢氧化饵-漂白粉测定法、燕麦种子荧光测定法、小麦种子氢氧化伺测定法)、聚丙烯曹先肢凝胶电泳法测定大麦、小麦种子纯度等。这些方法所需的检验周期较长，虽然电泳法所需时间短，但不具备分子水平鉴定的诸多优点。随着分子生物学的发展，特别是20世纪90年代以来，分子生物学的相关技术已被广泛应用，其检测对象为DNA大分子一一生物的遗传基础。以DNA为检测对象，具有许多其他检测水平所不具备的优点:首先，可供探测DNA标记的数量是无限的，这是同工酶
3、技术所无法比拟的;其二，DNA分析技术不像其他技术那样随组织或发育阶段而异，植物体任何部位、任何时期提供的DNA均可用于分析，其检测结果都是一样的;第三，DNA分析不受环境影响，其变异只摞于等位基因DNA序列的变异，这种稳定性便于揭示品种间的遗传变异，从而排除了环境变异所造成的表型变异。基于上述优点，DNA分析技术是农、林、牧、渔等品种鉴定的先进方法。E 1 范围大豆种子品种鉴定实验方法简单重复序列间区法本标准规定了大豆种子品种鉴定的实验方、本标准适用于利用简单重复序列问2 术语、定义和缩略语2. 1. 1 聚合酶链式反应少至一个拷贝的2. 1. 2 简单重复序列l是在PCR技设计出一系列特异
4、态性。2. 1. 3 微卫星DNA是一类由几个序列。2. 1. 4 核昔酸是构成核酸的基本单.J，2. 1.5 引物primer 一条互补结合在模板DNA链板DNA的互补链。2. 1. 6 引物扩增多态性primer amplified polymorphism GB/T 19563-2004 (微卫星位点)片段长度的多NA合成的起点，延伸合成模一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或长度不同的DNA片断。2.2 缩略语下列缩略语适用于本标准。ISSR 简单重复序列间区CInter-SimpleSequence Repeat) PCR 聚合酶链式反应CPolymer
5、aseChain Reaction) DNA 脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicAcid) GB/T 19563一2004RNA核糖核酸CRibonucleicAcid) OD 光密度(OpticalDensity) TBE 三连基氨基甲烧-棚酸-乙二股四乙酸二铀(TrisBoric-acid EDTA) 3 实验方法3. 1 原理DNA是生物体的遗传基础，携带所有的遗传物质，从DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种甚至个体之间差异最为有效的方法。利用PCR技术可将DNA片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍，从而达到可以检测的目的。ISSR方法是在PCR技术基础上发展起来的一种检测
6、方法，是根据简单重复序列(微卫星位点)设计出一系列特异引物，包括双核昔酸、三核昔酸和四核昔酸等为重复单位的微卫星DNA片段(一般为20个碱基)，通过PCR反应扩增微卫星位点及其间隔区，以检测其扩增片段的多态性。3.2 环境条件a) 温度:150C250C;b) 湿度z相对湿度CRH)不大于50%。3.3 仪器a) PCR扩增仪;b) 紫外分光光度计;c) 高速台式离心机:转速不小于15000 r/min; d) 多用电泳仪及水平式电泳槽p的紫外透射仪;f) 微量移液器:规格为O.1L2.5L、2L，.，20L、20L，.，200L、100L，.，l000L; g) 电子天平z分度值为0.000
7、1 g; h) 磁力加热搅拌器zi) 凝胶成像系统;j) 超纯水系统pk) 灭菌锅;1) 酸度计t最大允许误差为:1:0.1pH; m) 微波炉pn) 恒温水洛锅z最大允许误差为土lOC;0) 恒温干燥箱t最大允许误差为士lOC。3.4 试剂和耗材3.4.1 试剂a) TaqDNA聚合酶z保存条件为一200C士20C;b) 10XBuffer:保存条件为一200C:I:20C;c) 四种脱氧核昔酸(4XdNTP):保存条件为一200C:I:20C;d) Mg2+:保存条件为一200C:I: 20C; e) RNA酶(元DNA酶):保存条件为一20C土20C;f) 琼脂糖(agarose);g)
8、 三短甲基氨基甲烧CTris):分子式为C4Hl1N03; h) 乙二股四乙酸二铀CEDTANa2. 2H20):分子式为CloH14N208Na2.2H20; i) 澳酣蓝(bromphenolblue sodium salt) :分子式为C19H9 Br4 05 SN的j) 二甲苯青FF(xylenecyanole FF):分子式为C25H27 N2 06 S2 N的2 k) 8白是基唾琳(hydroxyquinoline):分子式为C9H7NO;1) 十二皖基磺酸铀(SD曰:分子式为C12H2504SN的m) 澳化乙键(EB):分子式为C21H20N3Br; n) 异戊醇:分子式为C5H
9、llOH;0) 结晶酣(pheno1):分子式为C6H60，保存条件为一200C土20C;p) 三氯甲烧z分子式为CHC13，纯度为分析纯;q) 棚酸(boricacid) :分子式为H3B03，纯度为分析纯;r) 煎糖(sucrose):分子式为C12H22011 ，纯度为分析纯;s) 无水乙醇z分子式为C2H50H，纯度为分析纯;t) 盐酸z分子式为HCl，纯度为分析纯;u) 氯化铀:分子式为NaCl，纯度为分析纯;v) 水:分子式为H20。本实验所用水均为去离子水。3.4.2 耗材GB/T 19563-2004 a) 离心管z规格为1.5 mL、0.2mL。使用前需进行高压灭菌(按第A.
10、1章中规定的方法进行操作hb) 研钵z规格为直径7cm10 cm; c) 移掖器吸头E规格为20L、200L和1000L。使用前需进行高压灭菌;d) 容量瓶z规格为100mL、1000 mL; 的烧杯:规格为100mL; f) 三角烧瓶z规格为250mL; g) PE手套;h) 锡锚纸;i) 封口膜。3.5 实验程序3.5.1 DNA的提取3.5. 1. 1 取大豆种子半粒，放在1.5 mL离心管中，加入1000L匀浆缓冲液(按第A.2章中规定的方法进行配制)浸泡4h，倒入研钵中充分研磨，将研磨产物倒入1.5 mL离心管中，取少量匀浆缓冲液冲洗研钵，一并倒入离心管中，离心(转速为4000r/m
11、in)10 min，将上清液移至新的1.5 mL离心管中，弃沉淀。3.5. 1.2 加入与上清液等体积的饱和酣(按第A.3章中规定的方法进行配制)，缓慢颠倒离心管20 min，避免剧烈振荡。3.5.1.3 离心(转速为8000r/min)10 min，将上清液移至新的离心管中。3.5. 1.4 加入与上清液等体积的酣-三氯甲烧-异戊醇(体积比为24: 23 : 1)，离心(转速为8000 r/min) 10 min，将上清液移至新的离心管中。3.5. 1. 5 加入与上清液等体积的三氯甲烧-异戊醇(体积比为23: 1)，缓慢颠倒10min，离心(转速为8000 r/min)10 min，取上清
12、液至新的离心管中。3.5.1.6 加入上清液二倍体积的冰冷乙醇，水平旋转离心管50圈100圈，即可出现白色絮状DNA。3.5.1.7 将离心管置于一200C冰箱中30min，取出后离心(转速为8000r/min)10 min，形成白色沉淀。3.5. 1.8 倒掉离心管中的液体，加入1mL 75%乙醇，离心(转速为15000 r/min)5 min，但j掉乙醇，倒置在干净的吸水纸上，吸干液体。3.5.1.9 将离心管置于恒温干燥箱(400C500C)中20min或置于通风处40min，使乙醇挥发。3. 5. 1. 10 加入100LTE缓冲液(按第A.4章中规定的方法进行配制)和RNA酶2L(按
13、第A.5章中规定的方法进行配制)，水浴(550C士20C)12h，使DNA沉淀充分熔解，40C冰箱中保存。3 GB/T 19563-2004 3.5. 2 DNA浓度的检测3. 5.2. 1 紫外吸收检测DNA分子中的瞟岭环和暗院环能够吸收紫外光。DNA的紫外吸收高峰在波长260nm处，蛋白质的紫外吸收高峰在波长280nm处。取3.5. 1中提取的DNA溶液5L，加水995L，放入比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下260nm和280nm下的OD值，计算出DNA的浓度以及OD60和ODso的比值。DNA的oD260 / 0 D2SO最好在1.8左右，1.5以上也可用于ISSR-PCR分析，若比
14、值太小应重复3.5. 1. 23. 5. 1. 10步骤继续抽提。DNA浓度按公式(1)计算:式中:D一-DNA的浓度，单位为5一一稀释倍数。3.5.2.2 凝胶电泳检测将制备好的浓度为O.样孔处于电源负极端，方法进行配制)。取封口膜上用微量移液5 V/cm，电泳1h，取在点样孔附近呈现DNA，只能在远离3.5.3 ISSR扩增3.5.3.1 反应成1mol/L引物，100按上述比例将反应3.5.3.2 循环过程循环过程如图l3.5.3.3 电泳检测图1PCR反应循环过程示意图( 1 ) A. 6. 3中规定的行配制)2L，在，将电压控制在kb)且无降解，11看不到大片段DNA聚合酶，的方法进
15、行)。将制备好的浓度为2%的琼脂糖凝胶(按第A.6章中规定的方法进行配制)放入电泳槽中，使点样孔处于电源负极端。取PCR扩增产物10L和凝胶加样缓冲液(按第A.7章中规定的方法进行配制)2L，在封口膜上用微量移液器上下吸打棍匀，加入到点样孔中。打开电惊，将电压控制在3V /cm，电泳4h，切断电隙，取出凝胶，在凝胶成像上扫描。3.5.3. 4 鉴定将待测品种的凝胶成像结果与该品种原种的标准谱带相比较，从而鉴定出该品种的真实性。4 GB/T 19563-2004 附录A(规范性附录)灭菌方法及缓冲液和主要试剂的配制A.1 高压灭菌的操作方法将欲灭菌的离心管放入烧杯中，用锡锚纸封口;移液器吸头装在
16、吸头盒内;配好的试剂装入试剂瓶中，盖好盖，放入灭菌锅中。首先将压力升至1Pa，放气，再将压力重新升至1Pa，开始计时，20min后，将电源关闭。待压力为零时，取出离d、牛-币、A.2 匀浆缓冲夜的配制取1mol/L Tris 100 mL。使用前应保A. 2. 1 1 mol/L T 至8.0，加水定容A. 2.2 0.5 A. 4. 1 1 mol/L Tri 至7.6，加水定容至1A.5 RNA酶(10mg/mL)的称取RNA酶1mg，溶于100LA.6 琼脂糖凝胶的配制o mL和O.5 g SDS，加水至HCl调节恪液的pH值水中，在磁力加热搅00 mL，高压灭菌。集液体。经重蒸体积O.
17、5 mol/L 此过程，直到酣相至100mL。HCl调节洛液的pH值)10 min，缓慢冷却至室温。配制浓度为0.7%(或2%)的琼脂糖凝胶需称取琼脂糖0.7g(或2g)置于200mL三角瓶中，溶于100 mL O. 5XTBE中，在微披炉中溶化至溶液透明，冷却至500C60oC，加入澳化乙链(10mg/ mL) ，调至终浓度为O.5g/mL，混匀后将凝胶倒入已封口并放好梳子(距底板1.0 mm左右)的载胶板上，凝胶厚度在3mm5 mm为宜，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中备用。A. 6.1 澳化乙链(EB)贮液(10mg/mL):称取1g澳化乙链，溶于100mL 水中，用磁力加热搅拌器搅拌数小时
18、以确保其完全溶解，移至棕色瓶中，40C冰箱中保存。5 GB/T 19563一2004A. 6. 2 5XTBE:称取54g Trs.榕于800mL水中，加入20mL O. 5 mol/L EDTACpH8. 0)和27.5g 棚酸，定容至1000 mL.高压灭菌，贮存于室温。A. 6. 3 0.5XTBE:称取5X TBE 100 mL.加水定容至1000 mL.备用。A.7 凝胶加样缠;中液0.25%澳酣蓝、0.25%二甲苯青FF、40%(质量浓度)醺糖水槽液。A.8 反应体系中备反应成分的配制A. 8. 1 1 U TaqDNA聚合酶25L反应体系中需加入TaqDNA聚合酶体积按公式(A.
19、1)计算:1-D 一V .( A.1 ) 式中:V一一TaqDNA聚合酶的体积，单位为微升(L); D一-TaqDNA聚合酶的浓度，单位为单位每微升CU/flL)0 A. 8. 2 1.5 mmol/L Mjf+ 25L反应体系中需加入Mg2+体积按公式(A.2)计算:v=1.互兰25D .( A.2 ) 式中:V一一-Mg2+的体积，单位为微升(L); D一一Mg2+的浓度，单位为毫摩尔每升(mmol/L)。A. 8. 3 10 .,mol/L 51物首先将引物离心，然后加水稀释。加水体积按公式(A.3)计算，放在一200C冰箱中保存，每次使用前用水稀释三倍，终浓度即为10mol/L。V-O
20、D260 33 -MX 10 其中公式(A.3)中M的计算按公式(A.的进行:M = nA X 313. 22 + nG X 329. 22十CX289.19十nTX 304.19 - 61. 97 ( A.4 ) .( A.3 ) 式中:V一一加水体积，单位为微升(L);M一-引物分子量，单位为克每毫升(g/mL); n 一一-碱基数;A一腺瞟岭(adenne); G一一鸟瞟岭(guanine); C一一一胞唔睫(cytosine); T一一胸腺嘈睫(thymine)。6 GB/T 19563一2004参考文献lJ J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆.北京t科学出版社，
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28、- 1676 口3JZavodna. M. ,J. Kraic , G. Paglia ,et al. Differentiation between closely related lentil (Lens cu linaris MEDIK. ) cultivars using DNA markers. Seed Sci Tech 28 2000.217 -219 14J Zhou. Z. H. ,M. Miwa, T. Hogetsu. Analysis of genetic structure of a Suillus grevillei popu lation in a Larix k
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