1、ICS 07.100.30 C 53 道雪中华人民共和国国家标准GB/T 19915.2-2005 猪链球菌2型分离鉴定操作规程Methods for detection of Stre ptococcus suis type 2 2005-09-27发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员俨2005-11-01实施060609000420 GB/T 19915.2一2005前言猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致发病和死亡。建立准确、可靠的检测方法是诊断、控制和预防该菌引致的猪链球菌病的迫切要求。
2、本标准是采用经典的细菌学鉴定方法并结合现代分子生物学技术制定的。本标准的附录A为资料性附录，附录B为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准由南京农业大学、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局和中国检验检疫科学院负责起草。本标准主要起草人z陆承平、姚火春、陈国强、张敬友、张常印、唐泰山、姜巍、王凯民、林样梅、韩雪清、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳。本标准为首次发布。I GB/T 19915.2一2005猪链球菌2型分离鉴定操作规程1 范围本标准规定了猪链球菌2型分离鉴定的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪链球菌2型的分离鉴定，也可用于送检菌株的
3、鉴定。2 规范性引用文件血清型。猪链球菌2一种重要的人畜共患4 操作规程4. 1 方法概要检验程序的流程示意图见附录A4.2 试荆和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的蒸馆水。各种培养基的制备方法见附录B(规范性附录)。4.3 仪器和设备4.3. 1 匀质器和匀质杯。4.3.2 天平:称量范围ogl 000 g，读数精度0.1g。4.3.3 培养箱:36.C土1.C。4.3.4 恒温水浴锅。134及1/2共35个以感染特定的人群，是GB/T 19915.2-2005 4.4 步骤4.4.1 样晶采集对病猪，最急性和急性病例可无菌采集死亡猪的心、肝、肺、肾、脾
4、脏、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一般采取关节液及周围组织F对活猪可采取扁桃体拭子、鼻腔拭子。4.4.2 分离培养4.4.2.1 迭栓菌株的分离划线接种于普通琼脂绵羊血平板，36c土1C培养24h土2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h土2 h，使之形成单个菌落，以供鉴定用。4.4.2.2 病料的分离和触片检查用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于普通琼脂绵羊血平板，于360C士10C培养24h士2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h:l: 2 h后观察。同时取病料做组织触片，姬姆萨染色(按GB/T4789.28的方法进行染色)后镜栓，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌。4.4.
5、2.3 扁桃体和鼻腔拭子的分离扁桃体和鼻腔拭子样品加入到含有5mL灭菌的选择性THB增菌液(见第B.4章)的试管中，于36C士lC培养24h士2h后，划线接种于选择性普通琼腊绵羊血平板(见第B.2章)。4.4.2.4 动物产晶的均质、增菌和分离以无菌操作取检样25g，加入装有225mL灭菌选择性THB增菌液见第B.4章)的广口瓶内，均质，于36.C士10C培养24h:l: 2 h后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板(见第B.2章)。4.4.3 初步鉴定猪链球菌2型在370C培养24h后，在普通琼脂绵羊血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直
6、径约O.3 mml mm，大多数菌株呈溶血，部分菌株产生R溶血。将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径约1m，固体培养物以双球菌为多，少量呈3个5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽抱，能形成英膜(按GB/T 4789. 28的方法进行染色)。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢酶试验符合者，可初步确定为链球菌。4.4.4 生化鉴定经初步鉴定后，做5%乳糖、海穰糖、七叶昔、甘露醇、山梨醇、马尿酸铀等糖发酵试验。猪链球菌2型发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶昔，不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸锅。或应用法国生物-梅里埃公司
7、API20Strep生化鉴定系统进行生化鉴定。4.4.5 玻片凝集试验将可疑菌落接种THB肉汤(见第B.3章)，于36.C士1.C培养18h土2h，取1.5 mL培养物，经10 000 r/min离心3min，弃上清，用100L生理盐水将沉淀悬浮，取25L菌体悬浮液分别和等体积的25L生理盐水、猪链球菌2型阳性血清作玻片凝集试验，其中生理盐水作为稀释液对照并观察待检菌株是否有自凝现象。同时设阳性菌株对照。在生理盐水对照不凝集，阳性菌株凝集的情况下，待检菌株出现凝集为阳性反应。4.4.6 猪链球菌2型定型PCR栓测见GB/T19915.3。4.4.7 猪链球菌2型毒力因子PCR检测必要时进行猪链
8、球菌2型毒力因子PCR检测。PCR检测方法见GB/T19915. 4, GB/T 19915. 5, GB/T 19915.7 ,GB/T 19915.8 ,GB/T 19915.9。5 试验结果分析判定5. 1 符合以下特性者应判为猪链球菌2型:GB/T 19915.2-2005 一一猪链球菌2型在37C培养24h后，在普通琼脂绵羊血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3mm-l mm，大多数菌株呈榕血，部分菌株产生日溶血;一一革兰氏阳性球菌，单个、成对或成链存在p一一过氧化氢酶试验阴性;一一发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶昔，
9、不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸铀(本试验项目具有不确定性，鉴定时供参考)，或法国生物-梅里埃公司API20Strep生化鉴定系统鉴定为猪链球菌2型者P一一与猪链球菌2型阳性血清玻片凝集试验阳性;一一一猪链球菌2型定型PCR检测阳性。5.2 符合以下特性者的菌株可判定为致病性猪链球菌2型菌株z一一符合5.1的特性p一一主要毒力基因(mrp、ef、orf2、sly)全部或之一PCR检测阳性。6 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。3 GB/T 19915.2-2005 附录A(资料性附录)猪链球菌2型检验程序主要毒力基因(mrp、eJ，orJ2, s仙全部或之-
10、PCR检测阳性致病性猪链球菌2型固A.l猪链球菌2型检验程序4 B. 1 普通琼脂绵羊血平植牛肉膏蛋白陈氯化铀(NaCD磷酸二氢梆(KH2P04) 牛肉膏蛋白陈氧化铀(NaCD磷酸二氢锦(K琼脂蒸馆水元菌羊血叠氮铀结晶紫亚硫酸铀B.3 Todd-Hewitt肉汤(简称牛肉膏膜蛋白陈葡葡糖碳酸铀氯化铀(NaCD磷酸氢二锅(Na2HP04) 蒸馆水附录B(规范性附录)备种培养基的配制方法3.0 g 2. 5 g 2.0 g GB/T 19915.2-2005 0.4 g;或十二水合磷酸氢二铀(Na2HP04 12H2 ) 1. 0 g 1 000 mL 将以上各成分混合煮沸，完全溶化，冷却至室温后
11、，调pH，于1l50C灭菌10min，最终pH为7.8。B.4 选择性Todd-Hewitt肉汤(简称选择性THB)牛肉膏5.0 g 5 GB/T 19915.2一2005膜蛋白陈葡萄糖碳酸铀氯化铀(NaCD磷酸氢二饷(NazHPO.)叠氮铀结晶紫亚硫酸铀蒸锢水20.0 g 2.0 g 2.5 g 2.0 g 0.4 g，或十二水合磷酸氢二铀(NazHPO. 12HzO) 1. 0 g 0.4 g 0.000 4 g 0.2 g 1000 mL 将以上各成分(结晶紫除外)混合煮沸，完全溶化，冷却至室温后，调pH.加入结晶紫(可配成适当溶液).于1l5C灭菌10mn.最终pH为7.8.6 由CON-N.mFgFH国。华人民共和国家标准猪链球菌2型分离鉴定操作规程GB/T 19915.2-2005 国白峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰印张O.75 字数11千字2005年12月第次印刷开本880X12301/16 2005年12月第一版峙定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-26801 GB/T 19915.
